楊文娟，馬青梅，馬 莉，馬夢(mèng)婷，張 倩，劉欣躍

蘭州大學(xué)第二醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中心，甘肅蘭州 730030

肺癌的發(fā)病率居各大癌癥之首，也是引起癌癥患者死亡的主要原因[1]。據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道，2018年肺癌發(fā)病和死亡人數(shù)分別為210萬(wàn)例、180萬(wàn)例，肺腺癌占所有肺癌的40%～55%，發(fā)病率逐年上升[2]。目前，尚缺乏對(duì)肺腺癌進(jìn)行有效診斷和預(yù)后評(píng)估的分子標(biāo)志物，導(dǎo)致大多數(shù)患者臨床確診時(shí)已處于晚期且5年生存率較低。因此，迫切需要分析肺腺癌預(yù)后的風(fēng)險(xiǎn)因素，以及確定肺腺癌的預(yù)后分子標(biāo)志物。

RNA結(jié)合蛋白(RBPs)是一類具有RNA結(jié)合域的蛋白總稱，包括信使RNA(mRNA)、長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNAs)、微小RNA(miRNAs)和核糖體RNA(rRNAs)等，參與剪接、修飾、轉(zhuǎn)運(yùn)、定位和翻譯等一系列生物學(xué)過(guò)程。此外，RBPs在維持細(xì)胞生理穩(wěn)態(tài)，尤其是發(fā)育和應(yīng)激反應(yīng)等方面也發(fā)揮重要功能[3]。GERSTBERGER等[4]已篩選出1 542種RBPs，然而目前僅有少數(shù)研究探討了RBPs的生物學(xué)功能及致病機(jī)制。研究報(bào)道稱大多數(shù)腫瘤中均有RBPs表達(dá)失調(diào)的現(xiàn)象，可能與腫瘤的發(fā)展、遷移、預(yù)后等過(guò)程密切相關(guān)[5-6]。本文對(duì)肺腺癌患者RNA測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，挖掘差異表達(dá)RBPs，探討RBPs對(duì)肺腺癌患者生存預(yù)后的影響。

1 資料與方法

1.1一般資料 從癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù)中下載526例肺腺癌組織和59例正常組織的RNA測(cè)序數(shù)據(jù)。為了擴(kuò)大正常組織的樣本數(shù)，下載基因型-組織表達(dá)(GTEx)數(shù)據(jù)庫(kù)中288例正常組織的RNA測(cè)序數(shù)據(jù)。以上TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫(kù)中肺腺癌和正常組織的測(cè)序數(shù)據(jù)均來(lái)自UCSC數(shù)據(jù)庫(kù)(https://xenabrowser.net/datapages/)。

1.2GO功能注釋和京都基因與基因組百科全書(KEGG)富集分析 為了明確差異表達(dá)RBPs在肺腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用，使用R軟件Clusterprofiler包對(duì)差異表達(dá)RBPs進(jìn)行功能富集分析，包括GO功能注釋[生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞學(xué)組分(CC)和分子生物學(xué)功能(MF)]和KEGG通路富集(BP)分析。

1.3生存分析 收集從UCSC數(shù)據(jù)庫(kù)中下載的500例肺腺癌患者的臨床信息，采用Perl軟件合并肺腺癌患者差異表達(dá)RBPs的表達(dá)和生存數(shù)據(jù)。通過(guò)單因素和多因素Cox回歸分析篩選關(guān)鍵RBPs。根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估公式：風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分=Exp1×Coe1+Exp2×Coe2+Expi×Coei(i、Exp和Coe分別表示關(guān)鍵RBPs的數(shù)目、表達(dá)值和系數(shù)值)，建立關(guān)鍵RBPs生存分析的預(yù)后模型。R軟件將關(guān)鍵RBPs的表達(dá)及生存數(shù)據(jù)隨機(jī)分為試驗(yàn)組(252例)和驗(yàn)證組(248例)，根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組，并繪制受試者工作特征曲線(ROC曲線)，計(jì)算曲線下面積(AUC)。此外，繪制驗(yàn)證組關(guān)鍵RBPs的ROC曲線并計(jì)算AUC值，對(duì)試驗(yàn)組風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估模型進(jìn)行驗(yàn)證。

1.4關(guān)鍵RBPs篩選和驗(yàn)證 采用Kaplan Meier-plotter數(shù)據(jù)庫(kù)(https://kmplot.com/analysis/)驗(yàn)證關(guān)鍵RBPs對(duì)肺腺癌預(yù)后總生存期(OS)的影響；采用人類蛋白質(zhì)圖譜(HPA)數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.proteinatlas.org/)對(duì)關(guān)鍵RBPs在肺腺癌中的表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證，進(jìn)一步驗(yàn)證構(gòu)建預(yù)后模型的有效性。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Perl軟件對(duì)下載的肺腺癌和正常組織的RNA測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行整理及合并，得到基因表達(dá)矩陣文件。根據(jù)已知的1 542個(gè)RBPs列表，用R軟件(3.6.1)獲取肺腺癌及正常組織中RBPs的表達(dá)矩陣。以|log2FC|>1且錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率<0.05為標(biāo)準(zhǔn)，R軟件Limma包篩選肺腺癌和正常組織中差異表達(dá)RBPs，Ggplot2包繪制差異表達(dá)RBPs的表達(dá)分布圖。

2 結(jié) 果

2.1肺腺癌中差異表達(dá)RBPs的篩選和富集分析 本研究共納入526例肺腺癌組織、347例正常組織的RNA測(cè)序數(shù)據(jù)。按照|log2FC|>1且錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率<0.05的標(biāo)準(zhǔn)，用R軟件Limma包篩選出375個(gè)差異表達(dá)RBPs。差異表達(dá)RBPs的GO分析結(jié)果表明，差異表達(dá)RBPs主要參與RNA代謝、lncRNA的代謝過(guò)程和RNA剪切等BP；MF主要為RNA的催化活性、核糖體結(jié)構(gòu)組成部分和核糖核酸酶活性；核糖體、線粒體基質(zhì)和核糖體亞單位等的CC。此外，差異表達(dá)RBPs參與核糖體、mRNA的監(jiān)控通路、RNA的轉(zhuǎn)錄和剪切體等KEGG通路。見(jiàn)表1。

表1 差異RBPs的功能富集表

2.2生存預(yù)后模型的構(gòu)建 對(duì)375個(gè)差異表達(dá)RBPs進(jìn)行單因素Cox回歸分析，獲得26個(gè)RBPs。對(duì)上述26個(gè)RBPs進(jìn)行多因素Cox回歸分析，得到8個(gè)關(guān)鍵RBPs(WDR3、SMG9、DARS2、CARHSP1、LARP6、GAR1、INTS7和EXO1)，它們是影響肺腺癌患者OS的獨(dú)立預(yù)后因素。將包含8個(gè)關(guān)鍵RBPs的表達(dá)及生存數(shù)據(jù)的肺腺癌患者，隨機(jī)分為試驗(yàn)組和驗(yàn)證組。按照風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估公式：風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分=(0.696×WDR3)+(0.764×SMG9)+(0.591×DARS2)+(0.675×CARHSP1)+(0.301×LARP6)+(0.526×GAR1)+(0.498×INTS7)+(-354×EXO1)，建立肺腺癌患者生存預(yù)后的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估模型。在試驗(yàn)組中，8個(gè)關(guān)鍵RBPs的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型的AUC為0.761，且高風(fēng)險(xiǎn)肺腺癌患者的OS較低風(fēng)險(xiǎn)者短，表明該模型對(duì)肺腺癌患者OS可進(jìn)行良好的預(yù)測(cè)。在驗(yàn)證組中，高風(fēng)險(xiǎn)肺腺癌患者OS較低風(fēng)險(xiǎn)者短，AUC為0.666。本研究成功構(gòu)建了具有較高的靈敏度和特異度的肺腺癌RBPs預(yù)后評(píng)估模型，見(jiàn)表2、圖1～2。

表2 多因素Cox回歸分析篩選關(guān)鍵RBPs

注：A為高、低風(fēng)險(xiǎn)患者的生存曲線圖；B為風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的OS的ROC曲線圖；C為風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分分布圖：D為生存狀態(tài)圖。

注：A為高、低風(fēng)險(xiǎn)患者的生存曲線圖；B為風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的OS的ROC曲線圖；C為風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分分布圖：D為生存狀態(tài)圖。

2.3關(guān)鍵RBPs的列線圖 為了定量預(yù)測(cè)肺腺癌患者1、3、5年的生存率，構(gòu)建8個(gè)關(guān)鍵RBPs的列線圖。在總點(diǎn)軸和各基因預(yù)后軸之間畫1條垂直線，進(jìn)而估算1、3和5年的生存率，為肺腺癌患者的臨床決策提供依據(jù)。見(jiàn)圖3。

圖3 預(yù)測(cè)肺腺癌患者1、3、5年總體生存時(shí)間的列線圖

2.4關(guān)鍵RBPs的預(yù)后和表達(dá)驗(yàn)證 通過(guò)Kaplan Meier-plotter數(shù)據(jù)庫(kù)明確肺腺癌患者中8個(gè)預(yù)后關(guān)鍵RBPs與OS的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)高表達(dá)WDR3、DARS2、CARHSP1、LARP6、GAR1、INTS7和EXO1基因的肺腺癌患者預(yù)后更差(P<0.05)；而SMG9對(duì)預(yù)后OS的影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。為了進(jìn)一步明確上述關(guān)鍵RBPs在肺腺癌中的表達(dá)情況，HPA數(shù)據(jù)庫(kù)免疫組化結(jié)果表明在肺癌組織中SMG9、DARS2、CARHSP1、LARP6、GAR1基因表達(dá)較正常組織高。然而，HPA數(shù)據(jù)庫(kù)尚缺乏WDR3、INTS7和EXO1基因的免疫組化表達(dá)數(shù)據(jù)。見(jiàn)圖4、5。

注：A～H分別為SMG9、WDR3、DARS2、CARHSP1、LARP6、GAR1、INTS7、EXO1高表達(dá)者和低表達(dá)者Kaplan Meier生存分析圖。

注：A為SMG9基因在正常組織中低表達(dá)；B為SMG9基因在肺腺癌組織高表達(dá)；C為DARS2基因在正常組織未檢測(cè)到；D為DARS2基因在肺腺癌組織高表達(dá)；E為CARHSP1基因在正常組織低表達(dá)；F為CARHSP1基因在肺腺癌組織中度表達(dá)；G為GAR1基因在正常組織高表達(dá)(25%～75%)；H為GAR1基因在肺腺癌組織高表達(dá)(>75%)；I為L(zhǎng)ARP6基因在正常組織低表達(dá)；J為L(zhǎng)ARP6基因在肺腺癌組織高表達(dá)。

3 討 論

本研究從UCSC數(shù)據(jù)庫(kù)中下載肺腺癌和正常組織的RNA測(cè)序數(shù)據(jù)，R軟件篩選差異表達(dá)的RBPs，獲得375個(gè)差異表達(dá)RBPs。通過(guò)單因素和多因素Cox回歸分析得到8個(gè)關(guān)鍵RBPs，成功構(gòu)建了肺腺癌患者RBP預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估模型，且驗(yàn)證組結(jié)果表明該模型具有較好的預(yù)后預(yù)測(cè)意義；構(gòu)建的列線圖進(jìn)一步直觀定量地描述了肺腺癌患者1、3、5年生存率。Kaplan Meier-plotter數(shù)據(jù)庫(kù)表明WDR3、DARS2、CARHSP1、LARP6、GAR1、INTS7和EXO1 7個(gè)關(guān)鍵RBPs高表達(dá)的肺腺癌患者的總體生存率較低表達(dá)患者低。使用HPA數(shù)據(jù)庫(kù)驗(yàn)證SMG9、DARS2、CARHSP1、LARP6、GAR1等基因在肺癌組織中高表達(dá)，與本研究所得結(jié)果一致。上述結(jié)論均表明，本研究建立的關(guān)鍵RBPs預(yù)后評(píng)估模型，對(duì)肺腺癌患者調(diào)整治療策略、預(yù)后標(biāo)志物的探索有一定的意義。

目前，已有研究者對(duì)預(yù)后關(guān)鍵RBPs在腫瘤中的作用展開(kāi)了多項(xiàng)研究。在西班牙人群中展開(kāi)的研究發(fā)現(xiàn)WDR3基因可增加甲狀腺癌的風(fēng)險(xiǎn)，且在甲狀腺癌細(xì)胞中WDR3表達(dá)上調(diào)[7]。研究表明DARS2基因可延長(zhǎng)肝細(xì)胞肝癌的細(xì)胞周期并抑制肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞的凋亡[8]；DARS2也參與膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移等過(guò)程[9]。胡仁旺等[10]發(fā)現(xiàn)LARP6的異常表達(dá)可影響胃癌患者的OS和無(wú)進(jìn)展生存期。研究表明GAR1在胃癌組織中尚無(wú)表達(dá)差異，而在結(jié)腸癌組織中表達(dá)上調(diào)，可能在結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[11]。INTS7在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起著重要作用，且具有高度突變性。前列腺癌的侵襲性與INST7的過(guò)表達(dá)有關(guān)[12]；INTST7被證實(shí)在胃癌、膀胱癌和肺腺癌中均為過(guò)表達(dá)[13]。EXO1基因異常表達(dá)可能影響前列腺癌患者的預(yù)后生存及進(jìn)展[14]；ZHENG等[15]發(fā)現(xiàn)，乳腺癌患者OS較短，與EXO1基因的表達(dá)上調(diào)有關(guān)。不同腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲及腫瘤患者的預(yù)后與關(guān)鍵RBPs的異常表達(dá)有關(guān)，未來(lái)可通過(guò)干擾上述RBPs的表達(dá)，改善肺腺癌患者的預(yù)后生存情況。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了肺腺癌關(guān)鍵RBPs預(yù)后評(píng)估模型，為進(jìn)一步探索RBPs對(duì)肺腺癌的影響提供了新思路，有助于臨床開(kāi)發(fā)新的靶向治療藥物，預(yù)測(cè)患者預(yù)后生存時(shí)間。然而，本研究尚存在一定的局限性，仍需要大量測(cè)序數(shù)據(jù)及相應(yīng)的前瞻性臨床試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。