祝 青，郭 琪，吳 穎，賀軍宇，鄒國英△，吳 意

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)教研室，湖南長沙 410208；2.湖南省腦科醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖南長沙 410007；3.湖南省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖南長沙 410005

膿毒癥是病原體感染機(jī)體引起免疫反應(yīng)失衡而導(dǎo)致危及生命的器官功能障礙，是重癥監(jiān)護(hù)病房(ICU)患者主要的死亡原因，病死率可高達(dá)20%[1]。革蘭陰性菌(G-)膿毒癥病情發(fā)展迅速、危險(xiǎn)急驟，若不及時(shí)治療，患者則容易在短時(shí)間內(nèi)發(fā)展成為膿毒癥休克，甚至死亡[2]。目前臨床常用降鈣素原(PCT)、C反應(yīng)蛋白(CRP)、白細(xì)胞介素(IL)-6、乳酸(LAC)、急性生理與慢性健康狀況評(píng)分(APACHEⅡ評(píng)分)早期診斷膿毒癥，但上述指標(biāo)缺乏特異性、容易受藥物治療情況影響，目前有關(guān)評(píng)估G-膿毒癥疾病嚴(yán)重程度和預(yù)后的研究較少[3-4]。有研究提示，前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9(PCSK9)是治療膿毒癥的潛在靶點(diǎn)[5]。脂多糖(LPS)是觸發(fā)G-膿毒癥炎性反應(yīng)的主要致病因素，通過調(diào)節(jié)低密度脂蛋白受體(LDLR)清除LPS，PCSK9可以通過下調(diào)LDLR數(shù)量而影響LPS的清除[6]。因此本文通過檢測患者血清中PCSK9水平，評(píng)估其在G-膿毒癥不同感染程度、病情嚴(yán)重程度、預(yù)后效能診斷中的價(jià)值，為指導(dǎo)臨床治療G-膿毒癥提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年9月至2020年9月入住湖南省腦科醫(yī)院(以下簡稱“本院”)ICU 48 h的90例G-膿毒癥患者為G-膿毒癥組，其中男49例、女41例，平均年齡(63.3±6.8)歲。另選擇38例革蘭陽性菌(G+)膿毒癥患者為G+膿毒癥組，其中男16例、女22例，平均年齡(60.8±8.6)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：臨床癥狀均有發(fā)熱(體溫≥38 ℃)，有感染癥狀或血培養(yǎng)陽性，序貫器官衰竭評(píng)分(SOFA評(píng)分)≥2分的患者。選取同期臨床癥狀表現(xiàn)為發(fā)熱但血培養(yǎng)為陰性的40例患者為單純?nèi)硌装Y反應(yīng)綜合征組(單純SIRS組)，其中男22例、女18例，平均年齡(64.8±7.2)歲。選取同期本院體檢中心的40例健康者為健康對照組，其中男20例、女20例，平均年齡(63.8±8.4)歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)入住ICU時(shí)間<24 h；(2)患有急慢性傳染病、腫瘤及自身免疫性疾病者；(3)患有糖尿病、冠心病、高脂血癥患者。4組研究對象的性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。根據(jù)文獻(xiàn)[7]對膿毒癥患者進(jìn)行診斷：感染(血液、尿、腦脊液、傷口、呼吸道分泌物、其他體液等標(biāo)本培養(yǎng)陽性)，同時(shí)SOFA評(píng)分≥2分的患者[8]。SIRS診斷標(biāo)準(zhǔn)：符合下述2項(xiàng)或2項(xiàng)以上即可診斷SIRS。(1)體溫>38 ℃或<36 ℃。(2)心率>90次/分或低血壓(收縮壓<90 mm Hg，或較基線降低>40 mm Hg)。(3)呼吸急促(>20次/分)或通氣障礙(動(dòng)脈血二氧化碳分壓<32 mm Hg)。(4)外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)>12.0×109/L或<4.0×109/L，或未成熟白細(xì)胞比例>10%，但排除可以引起上述急性異常改變的其他原因。根據(jù)APACHEⅡ評(píng)分[9]判斷G-膿毒癥患者的病情嚴(yán)重程度，分為輕度組(≤43分)、中度組(>43～53分)和重度組(>53分)；根據(jù)G-膿毒癥患者出院時(shí)預(yù)后情況，將病情穩(wěn)定、好轉(zhuǎn)、治愈的患者記為預(yù)后良好組，將患者出院時(shí)意識(shí)昏迷、昏睡、放棄治療、死亡的患者記為預(yù)后不良組。本研究獲醫(yī)院倫理會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2儀器與試劑 Multiskan NK3酶標(biāo)儀(默飛世爾儀器有限公司)；Cobas E601電化學(xué)發(fā)光分析儀(Roche公司)；CL-6000i全自動(dòng)發(fā)光分析儀(邁瑞有限公司)；PCSK9和載脂蛋白M(apoM)酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)檢測試劑盒(長沙生物科技有限公司產(chǎn)品)；IL-6和PCT電化學(xué)發(fā)光試劑盒，Roche配套產(chǎn)品(Roche公司)；LAC測定試劑盒(湖南永和陽光生物科技股份有限公司)；CRP試劑盒(九強(qiáng)生物技術(shù)股份有限公司)。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本采集與處理 采集研究對象空腹靜脈血，3 000 r/min離心10 min，吸取血清3 mL于EP管置-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2各指標(biāo)的檢測 血清PCSK9和apoM水平的測定采用ELISA法，嚴(yán)格按試劑盒操作：設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔、空白孔和樣本孔，分別加入血清50 μL，再加入酶標(biāo)記物100 μL，37 ℃孵育60 min，洗滌1 min，共洗滌5次，加底物A和B液各50 μL，于37 ℃溫育15 min顯色，終止反應(yīng)后在450 nm波長處測定吸光度值(A450 nm)，計(jì)算PCSK9和apoM水平。血清IL-6和PCT的檢測采用電化學(xué)發(fā)光法，按儀器與試劑盒操作說明在Cobas E601電化學(xué)發(fā)光分析儀上測定。血清CRP測定采用乳膠免疫比濁法，血清LAC測定采用乳酸氧化酶法，按照各自的試劑盒說明書進(jìn)行操作，在CL-6000i全自動(dòng)發(fā)光分析儀上分析結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1各組研究對象血清中PCT、IL-6和CRP水平的比較 與健康對照組比較，單純SIRS組、G+膿毒癥組、G-膿毒癥組血清PCT、IL-6、CRP水平明顯增高(P<0.05)；與單純SIRS組比較，G-膿毒癥組血清CRP水平明顯升高(P<0.05)；與G+膿毒癥組比較，G-膿毒癥組血清PCT、CRP水平明顯增高(P<0.05)，見表1。

表1 各組研究對象血清中PCT、IL-6和CRP水平的比較[M(P25，P75)]

2.2各組研究對象血清中LAC、PCSK9和apoM水平的比較 與健康對照組比較，單純SIRS組、G+膿毒癥組、G-膿毒癥組血清LAC、PCSK9水平明顯升高，但apoM水平明顯降低(P<0.05)；與單純SIRS組和G+膿毒癥組比較，G-膿毒癥組血清PCSK9、LAC水平明顯升高(P<0.05)，apoM水平明顯降低(P<0.05)；G-膿毒癥組血清apoM水平明顯低于單純SIRS組(P<0.05)，見表2。

表2 各組研究對象血清中LAC、PCSK9和apoM水平比較[M(P25，P75)]

2.3G-膿毒癥不同病情嚴(yán)重程度患者血清中PCSK9和apoM的比較 隨著G-膿毒癥病情的加重，PCSK9水平在輕度組、中度組、重度組中呈增高趨勢，但apoM水平呈降低趨勢(P<0.05)，見表3。

表3 G-膿毒癥不同嚴(yán)重程度患者血清中PCSK9和apoM水平的比較[M(P25，P75)]

2.4影響G-膿毒癥患者預(yù)后的單因素分析 對患者出院時(shí)預(yù)后情況進(jìn)行分析，其中預(yù)后不良組26例，預(yù)后良好組64例。與預(yù)后良好組比較，預(yù)后不良組血清PSCK9、PCT、LAC、CRP及APOCHEⅡ評(píng)分明顯增高，但apoM水平明顯降低(P<0.05)，見表4。

表4 影響G-膿毒癥患者預(yù)后的單因素分析[M(P25，P75)]

組別nPCSK9(μg/L)apoM(mg/L)APACHEⅡ評(píng)分(分)SOFA評(píng)分(分)預(yù)后良好組647.78(6.31,32.55)147.04(83.39,220.90)25.00(17.00,37.00)4.00(3.00,6.00)預(yù)后不良組2696.31(25.53,207.03)64.50(40.42,120.40)37.00(25.00,43.00)5.00(3.00,6.00)Z-5.3804.617-2.753-0.055P<0.001<0.0010.0060.957

2.5影響G-膿毒癥預(yù)后的多因素分析 多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示，PSCK9、apoM、APACHEⅡ評(píng)分是G-膿毒癥預(yù)后的獨(dú)立影響因素(P<0.05)，見表5。

表5 影響G-膿毒癥預(yù)后的多因素Logistic回歸分析

2.6apoM及PCSK9預(yù)測G-膿毒癥的預(yù)后效能 apoM和PCSK9預(yù)測G-膿毒癥預(yù)后不良的曲線下面積(AUC)分別為0.817 8和0.794 0，低于APACHEⅡ評(píng)分的0.877 1。但PCSK9的特異度(94.44%)高于APACHEⅡ評(píng)分(90.74%)，apoM的靈敏度(86.49%)高于APACHEⅡ評(píng)分(78.38%)。

3 討 論

膿毒癥是感染、休克、外傷等的常見并發(fā)癥，發(fā)病率及病死率仍居高不下，成為ICU患者主要的死因之一。診斷膿毒癥的金標(biāo)準(zhǔn)是血培養(yǎng)，但耗時(shí)過長。目前已有170余種不同的生物標(biāo)志物可對膿毒癥進(jìn)行診斷和評(píng)價(jià)，但是尚缺乏特異度和靈敏度均較高的生物標(biāo)志物[10]。PCT、IL-6和CRP是目前臨床常用且參考意義較大的細(xì)菌感染標(biāo)志物，但缺乏特異性，非感染性疾病患者PCT水平也會(huì)升高[11]。研究表明，ICU患者血清三酰甘油水平與膿毒癥病死率相關(guān)[12]。膿毒癥的致病因素多，涉及炎癥、免疫、凝血等多系統(tǒng)、多器官的病理生理過程，因此尋找能用于早診斷、病情判斷、評(píng)估預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物尤為重要。

G-膿毒癥是由G-感染所致的膿毒癥，其主要致病因素為G-的LPS。LPS通過Toll樣受體4(TLR4)信號(hào)通路觸發(fā)炎性反應(yīng)，刺激炎癥細(xì)胞釋放相關(guān)炎癥因子，導(dǎo)致彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)、多器官功能障礙綜合征(MODS)，若不及時(shí)治療，可出現(xiàn)膿毒癥休克，甚至死亡[13]。機(jī)體中的LPS通過LDLR途徑在肝臟發(fā)生反應(yīng)，經(jīng)膽管、腸道排出體外[14]。PCSK9由肝臟合成、分泌入血，通過調(diào)控膽固醇代謝途徑影響膿毒癥脂代謝紊亂特異性分子的代謝[15]。生理情況下，肝細(xì)胞膜表面上的受體LDLR與血液低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)結(jié)合形成復(fù)合物，通過胞吞進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，在低pH值時(shí)LDLR在內(nèi)體小泡中與LDL-C分離，LDL-C被溶酶體降解，LDLR重新回到肝細(xì)胞表面被重復(fù)利用。研究表明，PCSK9是LDLR的關(guān)鍵性負(fù)調(diào)節(jié)因子，膿毒癥患者中PCSK9水平增加，PCSK9入血與LDLR結(jié)合形成復(fù)合物，復(fù)合物遷移至溶酶體中被降解，LDLR無法回到肝細(xì)胞表面被重復(fù)利用，從而影響脂蛋白對LPS的吸收，降低LPS的清除率[16]。PCSK9通過TLR4受體激活NF-KB信號(hào)通路激活炎癥，加重膿毒癥的病情。本研究結(jié)果顯示，G-膿毒癥組患者血清PCKS9、IL-6、CRP、PCT、LAC水平均明顯高于健康對照組，且G-膿毒癥患者血清PCSK9水平明顯高于單純SIRS組和G+膿毒癥組(P<0.05)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，PCSK9水平隨著病情進(jìn)展呈明顯增高趨勢。因此，監(jiān)測膿毒癥患者血清PCSK9水平對早期診斷G-膿毒癥、評(píng)估G-膿毒癥的病情有一定積極意義。apoM是LDL和高密度脂蛋白(HDL)的主要成分，與多功能生物活性脂質(zhì)介質(zhì)S1P結(jié)合，保護(hù)血管內(nèi)皮屏障功能[17]。膿毒癥患者血漿S1P水平于發(fā)病后6～8 h下降，apoM 于發(fā)病后12～24 h降低，內(nèi)皮屏障功能被破壞，血管滲漏增加，膿毒癥病情越嚴(yán)重，apoM水平越低，越易引發(fā)休克[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，G-膿毒癥組血清apoM水平明顯低于健康對照組和單純SIRS組，G-膿毒癥患者血清apoM水平隨著病情進(jìn)展呈明顯降低趨勢，且預(yù)后不良組血清apoM水平明顯低于預(yù)后良好組，表明血清apoM水平降低對G-膿毒癥的診斷、病情判斷有一定意義。

通過單因素及多因素Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，APACHEⅡ評(píng)分、PCSK9、apoM是評(píng)估G-膿毒癥預(yù)后的獨(dú)立影響因素。ROC曲線分析提示，PCSK9、apoM和APACHEⅡ評(píng)分均能較好地預(yù)測G-膿毒癥的預(yù)后。

綜上所述，G-膿毒癥患者的血清PCSK9、apoM水平與健康對照者差異明顯，兩者水平與G-膿毒癥的病情相關(guān)，是G-膿毒癥預(yù)后的獨(dú)立影響因素。血清PCSK9、apoM水平與APACHEⅡ評(píng)分可用于評(píng)估G-膿毒癥的預(yù)后。在實(shí)際工作，可與APACHEⅡ評(píng)分聯(lián)合使用，判斷G-膿毒癥的病情與預(yù)后。但本研究病例數(shù)較少，研究結(jié)果可能存在偏倚，還需要大樣本研究進(jìn)行驗(yàn)證。