牛棟玲，趙亞娥，張宛鈺，郭宏松，胡麗

西安交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)與免疫學(xué)系，陜西 西安 710061

本課題組前期通過轉(zhuǎn)錄組測序、qRT-PCR檢測和RNA干擾，確認(rèn)了熱休克蛋白家族(HSPs)中有17種基因參與粉塵螨溫度應(yīng)激響應(yīng)，起關(guān)鍵應(yīng)激調(diào)節(jié)作用的基因有6種，即HSF、HSC71、HSP70、HSP83-1、HSP83-2和HSP16-1，且各關(guān)鍵基因調(diào)節(jié)規(guī)律各不相同。HSP70、HSP83-1、HSP83-2和HSP16-1只參與熱應(yīng)激響應(yīng)，而HSF和HSC71在熱應(yīng)激和冷應(yīng)激響應(yīng)中均發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[8-10]。該研究第一次在mRNA水平確認(rèn)了公認(rèn)的生物應(yīng)激響應(yīng)基因HSPs參與粉塵螨抵抗溫度脅迫的應(yīng)激響應(yīng)。然而，mRNA水平的改變并不能直接反映蛋白質(zhì)水平的改變。目前雖然能夠檢索到螨類HSPs原核表達(dá)的相關(guān)文獻(xiàn)[11-13]，但都是原核表達(dá)體系構(gòu)建和重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)，缺乏蛋白水平的功能驗(yàn)證。

本研究選擇粉塵螨HSP16-1為目的基因，嘗試建立原核表達(dá)體系，探索重組蛋白表達(dá)的最佳誘導(dǎo)條件，通過繪制重組菌和空載菌在熱脅迫和冷脅迫下的生長曲線，從蛋白水平驗(yàn)證HSP16-1在溫度脅迫下的應(yīng)激響應(yīng)功能。這些研究結(jié)果將為深入探討粉塵螨HSF、HSP70s和HSP90s等重要HSPs在溫度應(yīng)激響應(yīng)中的作用機(jī)制及生物學(xué)功能奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1螨蟲培養(yǎng)與收集實(shí)驗(yàn)用粉塵螨來自本實(shí)驗(yàn)室人工氣候培養(yǎng)箱純培養(yǎng)，設(shè)置溫度為(25 ± 1)℃，濕度為70%～75%。振篩分離法獲取含螨粉塵[9]，采用自制取螨針在顯微鏡下分離粉塵螨雌性成蟲。

1.1.2主要儀器與試劑智能人工氣候培養(yǎng)箱和恒溫水浴鍋(東南儀器，中國)；視頻顯微鏡(麥克奧迪，中國)；普通PCR儀(Thermo scientific，美國)；實(shí)時(shí)定量PCR儀(Agilent Mx3005P，美國)；超聲波細(xì)胞破碎儀(上海之信，中國)；脫色搖床(其林貝爾，中國)；掃描儀(Umax，美國)；微量RNA 提取試劑盒(Qiagen，美國)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、高保真酶PrimeSTAR? HS DNA Polymerase、BamHⅠ、XhoⅠ、T4連接酶(TaKaRa，中國)；E.coliDH5α和BL2(DE3)感受態(tài)細(xì)胞(天根，中國)；膠回收試劑盒(OMEGA，美國)；BCA蛋白定量試劑盒(鼎國，中國)；SDS-PAGE 快速凝膠試劑盒(赫特，中國)；預(yù)染蛋白Marker(Thermal Fisher，美國)；細(xì)菌裂解液(行知生物科技，中國)；蛋白上樣緩沖液(赫特，中國)；凝膠成像系統(tǒng)(賽智，中國)；電泳儀(伯樂，美國) 。

1.2方法

1.2.1粉塵螨總RNA提取與cDNA合成選取本實(shí)驗(yàn)室人工氣候培養(yǎng)箱純培養(yǎng)的粉塵螨，振篩分離法獲取含螨粉塵，平鋪在干凈玻片上，靜置幾分鐘后，于顯微鏡下挑取活雌性成螨約500只，置于15 mL無菌無酶離心管，液氮研磨破膜。按照微量RNA 提取試劑盒說明書提取粉塵螨雌性成螨總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

海南瓊中抽水蓄能電站上水庫副壩一壩址位于一沖溝內(nèi)，壩基防滲墻厚0.8m，最大墻深約60m，墻底深入至弱風(fēng)化基巖。副壩一壩址覆蓋層分布廣，全風(fēng)化帶下限埋深50m～57m，地表有厚近10m的淤泥層，傳統(tǒng)防滲墻施工工藝成槽難度極大，在使用液壓抓斗配合沖孔樁機(jī)施工多次成槽失敗后，更換采用德國生產(chǎn)的BC30雙輪銑槽機(jī)直接銑槽施工，利用其成槽過程中對地層擾動(dòng)少的優(yōu)點(diǎn)，順利實(shí)現(xiàn)成槽澆筑，最終按期圓滿完成了基礎(chǔ)防滲施工。

1.2.3pET32a/HSP16-1重組質(zhì)粒構(gòu)建與鑒定 純化BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切的HSP16-1 ORF和pET32a載體，采用T4連接酶連接后，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行克隆。通過Amp(+)LB固體培養(yǎng)基篩選陽性克隆，隨機(jī)挑取單菌落進(jìn)行質(zhì)粒PCR鑒定，陽性克隆送蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行測序，通過BLAST比對確認(rèn)序列及近緣物種。

1.2.4HSP16-1生物信息學(xué)分析 用ProtParam軟件預(yù)測蛋白質(zhì)組成和理化性質(zhì)。用ExPASy中的Prot Scale軟件進(jìn)行氨基酸的疏水性分析。蛋白質(zhì)信號(hào)肽用signalP-5.0預(yù)測。用NCBI Conserved Domains Search(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/)預(yù)測保守區(qū)。蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測使用softberry軟件(http://www.softberry.com/berry.phtml?topic=protcom pan &group=programs &subgroup=proloc)。使用在線軟件SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/interactive)對其空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測。

1.2.5重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和條件優(yōu)化 將測序正確的pET32a/HSP16-1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，PCR電泳初步鑒定陽性克隆。提取進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)，當(dāng)OD600為0.4～0.6時(shí)，用1.0 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)溫度選擇16、28和37 ℃[14],誘導(dǎo)時(shí)間選擇2、4、6和8 h，分別取菌液5 mL。4 ℃10 000×g離心10 min，棄上清，加入1 000 μL PBS重懸洗滌。往重懸菌液中加入細(xì)菌裂解液150 μL，冰上靜置30 min后，超聲破碎細(xì)胞膜，超聲功率90 W，工作10 s間隙10 s，約5～10個(gè)循環(huán)，直至液體澄清。參照BCA蛋白定量試劑盒說明書進(jìn)行蛋白濃度測定，繪制BSA蛋白定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品濃度。加入5×上樣緩沖液重懸，金屬浴煮沸10 min 使蛋白樣品變性，離心收集上清，經(jīng)10% SDS-PAGE電泳檢測分析蛋白表達(dá)結(jié)果，篩選HSP16-1重組蛋白表達(dá)的最佳誘導(dǎo)條件。

1.2.6原核重組表達(dá)菌溫度脅迫下生長曲線繪制將pET32a和pET32a/HSP16-1菌株各單克隆3個(gè)，在液體LB培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)，OD600為0.4～0.6時(shí)，加入IPTG在最佳條件下誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，調(diào)節(jié)各菌液OD值一致，取1%接種到新鮮培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)，每隔1 h測定一次各菌液OD值，并記錄數(shù)據(jù)，繪制誘導(dǎo)后37 ℃生長曲線。然后分別在41 ℃水浴鍋和-7 ℃冰鹽浴處理6、12和24 h，再次1%接種，37 ℃培養(yǎng)，最后繪制熱脅迫和冷脅迫下細(xì)菌生長曲線。

2 結(jié) 果

2.1粉塵螨HSP16-1序列比對與分析 粉塵螨HSP16-1經(jīng)特異性引物PCR擴(kuò)增，電泳顯示的條帶與目的片段大小一致，見圖1A；經(jīng)克隆測序獲得462 bp核苷酸序列，比對顯示與轉(zhuǎn)錄組測序的HSP16-1基因開放閱讀框(Genbank：MK896232)完全一致，未發(fā)現(xiàn)堿基突變，可編碼153個(gè)氨基酸，見圖1B。核苷酸和氨基酸序列經(jīng)BLAST比對，覆蓋度為100%的分別只比對上一條序列，均為近緣物種屋塵螨α晶體蛋白A鏈(XM_027339750，XP_027195551)，相似度分別為84.63%和87.58%。

注：A為HSP16-1 PCR擴(kuò)增，M為DL1000 DNA marker，1為HSP16-1 ORF；B為HSP16-1核苷酸氨基酸序列比對，紅色字體為預(yù)測的保守區(qū)；C為 HSP16-1三維結(jié)構(gòu)。

ProtParam分析顯示，粉塵螨HSP16-1分子量為17.93 kDa，理論等電點(diǎn)為6.83，帶負(fù)極殘基(Asp+Glu)22個(gè)，正極殘基(Arg+Lys)22個(gè)，總原子數(shù)2 506，預(yù)測分子式為C786H1249N225O237S9。在編碼的153個(gè)氨基酸中，含量最多的為Lys(K)9.2%，其次為Asn(N)8.5%、Asp(D)8.5%、Gln(Q)8.5%和Val(V)8.5%。不穩(wěn)定系數(shù)47.98，為不穩(wěn)定蛋白；親水性指數(shù)GRAVY-0.808，為疏水性蛋白；脂肪指數(shù)74.44。蛋白定位綜合預(yù)測顯示HSP16-1定位于細(xì)胞核，得分2.5。signalP-5.0預(yù)測HSP16-1未發(fā)現(xiàn)信號(hào)肽。預(yù)測的粉塵螨HSP16-1三維結(jié)構(gòu)如圖1C所示。

粉塵螨HSP16-1保守區(qū)預(yù)測，發(fā)現(xiàn)氨基酸序列有一個(gè)α晶體蛋白HSP23超家族的保守區(qū)，共74個(gè)氨基酸(在54～127位氨基酸)，即NFDVRNFDPNSVQVKLDGNNLQVQAKQEKKADGHYEYREFVRHVTVPQNVQSDQLKCKMDKDGVLRFEAPLKQI；與屋塵螨和梅內(nèi)歐塵螨相似度高達(dá)93%和92%。

2.2重組質(zhì)粒構(gòu)建 重組質(zhì)粒菌液PCR檢測顯示均有陽性條帶，表明轉(zhuǎn)化成功，見圖2A。挑取陽性單克隆于37 ℃恒溫振蕩過夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，雙酶切成功得到pET32a和HSP16-1兩條帶，說明原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a/HSP16-1構(gòu)建成功，見圖2B。

注：A為粉塵螨pET32a/HSP16-1重組質(zhì)粒菌液PCR，M為DL1000 DNA ladder，1-12為pET32a/HSP16-1重組菌單克隆1-12；B為雙酶切鑒定，M1為1 kb DNA ladder，1為pET32a/HSP16-1重組質(zhì)粒，2為雙酶切pET32a/HSP16-1質(zhì)粒，M2為DL1000 DNA ladder，白色箭頭表示雙酶切的HSP16-1 ORF。

注：A為BSA蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線；B為不同誘導(dǎo)條件HSP16-1重組蛋白表達(dá)SDS-PAGE分析，M為蛋白Marker，NC為pET32a空載菌。

2.3重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá) BSA蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.106 3x+0.019 5，R2=0.999 5，說明線性關(guān)系良好，能夠準(zhǔn)確定量待檢蛋白濃度，見圖3A。HSP16-1重組蛋白可被成功誘導(dǎo)表達(dá)，融合蛋白分子量約為35.8 kDa，為HSP16-1(17.9 kDa)與pET32a標(biāo)簽蛋白(17.9 kDa)分子量之和。選擇16、28、37 ℃三個(gè)溫度和2、4、6、8 h四個(gè)誘導(dǎo)時(shí)間，SDS-PAGE顯示37 ℃誘導(dǎo)6 h為最佳誘導(dǎo)條件，誘導(dǎo)效果最好，見圖3B。

2.4溫度脅迫對HSP16-1重組菌生長的影響 細(xì)菌生長曲線顯示，pET32a/HSP16-1重組菌和pET32a空載菌在37 ℃未誘導(dǎo)時(shí)生長曲線一致(t=1.580，P=0.140 0)，見圖4A；而在37 ℃誘導(dǎo)6 h后，重組菌隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長，生長好于空載菌，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.334，P<0.05)，見圖4B。

注：A為37 ℃未誘導(dǎo)時(shí)生長曲線；B為37 ℃誘導(dǎo)后生長曲線；無差異表示兩組比較，P>0.05；***表示兩組比較,P<0.001。

41 ℃分別熱脅迫6、12和24 h，pET32a/HSP16-1重組菌和空載菌生長曲線均明顯好于37 ℃誘導(dǎo)菌；重組菌生長曲線好于空載菌(t=8.767、6.942、6.320，P均<0.05)；細(xì)菌生長曲線與脅迫時(shí)間有關(guān)，熱脅迫時(shí)間越長，起初1～3 h細(xì)菌生長越緩慢，但之后細(xì)菌繁殖速度呈快速增長的趨勢，見圖5。

在-7 ℃分別冷脅迫6、12和24 h，則結(jié)果有所不同。冷脅迫后，pET32a/HSP16-1重組菌和空載菌的生長直接受到影響，生長曲線在起初7～8 h內(nèi)低于37 ℃誘導(dǎo)菌，之后細(xì)菌快速生長，高于37 ℃誘導(dǎo)菌；空載菌生長好于重組菌(t=8.874、7.158、5.550，P均<0.05)，見圖6。

注：A為-7 ℃冷脅迫6 h；B為-7 ℃冷脅迫12 h；C為-7 ℃冷脅迫24 h；****表示兩組比較,P<0.0001；***表示兩組比較,P<0.001。

3 討 論

本研究在前期從mRNA水平確認(rèn)粉塵螨多個(gè)HSPs參與溫度應(yīng)激響應(yīng)的背景下，選擇HSP16-1嘗試建立原核表達(dá)體系，完成了蛋白水平的功能確認(rèn)。選擇HSP16-1作為原核表達(dá)的目的基因，其原因主要有：相對于HSP70s、HSP90s和HSF等多個(gè)HSP基因，HSP16-1基礎(chǔ)表達(dá)量高(FPKM為3 864.36)，核苷酸序列較短(462 bp)，利于PCR擴(kuò)增測序；相對于HSP16-2在41 ℃熱脅迫上調(diào)3.27倍，HSP16-1上調(diào)4.00倍，調(diào)節(jié)作用強(qiáng)[10]。經(jīng)過生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)粉塵螨HSP16-1屬于HSPs中的α晶體蛋白A鏈亞家族成員，與HSPs的典型結(jié)構(gòu)特征相一致[15]。檢索NCBI數(shù)據(jù)庫，目前收錄的螨類HSP16s基因序列僅有4條，涉及屋塵螨(Genbank:XP027195551)、梅內(nèi)歐塵螨(Genbank:OTF73758)、地里纖恙螨(Genbank:RWS26778)和二斑葉螨(Genbank:XP015781289)，而粉塵螨HSP16基因未被收錄。我們以前期RNA-seq獲得的HSP16-1序列為模板，設(shè)計(jì)特異性引物，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄、PCR擴(kuò)增和測序，成功獲得了粉塵螨HSP16-1全長編碼區(qū)序列(coding sequence，CDS)，全長462 bp。經(jīng)序列比對，與RNA-seq獲得的ORF模板完全一致，沒有堿基突變。已投遞至GenBank，為今后粉塵螨HSPs基因的研究提供了序列模板。

蛋白質(zhì)生物學(xué)功能的發(fā)揮依賴于正確折疊的三維結(jié)構(gòu)，因此對蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的預(yù)測十分必要。常采用計(jì)算機(jī)模擬來預(yù)測三維結(jié)構(gòu)，同源建模是目前比較主流的思路。通過對預(yù)模擬的蛋白質(zhì)序列與PDB數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行相似性搜索，根據(jù)相似序列的結(jié)構(gòu)來預(yù)測，具有預(yù)測速度快、結(jié)果準(zhǔn)確度高的優(yōu)點(diǎn)。本研究選擇的SWISS-MODEL在線軟件基于同源建模方法進(jìn)行，成功預(yù)測出了粉塵螨HSP16-1蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)，為更好地從空間結(jié)構(gòu)的角度研究HSP16-1蛋白的生物學(xué)機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

要實(shí)現(xiàn)蛋白水平的功能研究，第一步是要獲得重組蛋白。本研究選擇大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)，嘗試對粉塵螨HSP16-1進(jìn)行蛋白表達(dá)。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是最早被采用和目前掌握最為成熟的表達(dá)系統(tǒng)，它具有遺傳背景清楚、繁殖快、產(chǎn)量高、成本低、IPTG誘導(dǎo)表達(dá)相對簡便、表達(dá)產(chǎn)物容易純化、穩(wěn)定性好、抗污染能力強(qiáng)以及適用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，是生產(chǎn)重組蛋白最常用的系統(tǒng)[16-17]。載體選擇pET32a，是因?yàn)閜ET載體在大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)中，基礎(chǔ)表達(dá)水平最低，更利于目標(biāo)基因的表達(dá)。研究設(shè)計(jì)了3個(gè)誘導(dǎo)溫度和4個(gè)時(shí)間梯度，最終篩選出粉塵螨HSP16-1最優(yōu)誘導(dǎo)表達(dá)條件為37 ℃誘導(dǎo)6 h。

近年有多項(xiàng)通過繪制細(xì)菌生長曲線以揭示非生物脅迫對玉米、番茄和木薯等植物生長功能影響的研究[18-20]。本研究借鑒這一技術(shù)，觀察HSP16-1蛋白對重組菌和空載菌在熱脅迫和冷脅迫下生長曲線變化，驗(yàn)證蛋白功能。研究發(fā)現(xiàn)，熱脅迫時(shí)重組菌的生長要明顯好于空載菌，可能是HSP16-1蛋白在重組菌中被大量誘導(dǎo)表達(dá)，發(fā)揮熱應(yīng)激響應(yīng)功能，使得重組菌對熱脅迫的抵抗力增強(qiáng)；而冷脅迫時(shí)重組菌的生長相對于空載菌較差，說明HSP16-1蛋白在冷脅迫不具有應(yīng)激響應(yīng)功能。這與前期HSP16-1 mRNA水平僅在熱脅迫上調(diào)的結(jié)果一致。研究還發(fā)現(xiàn)冷脅迫細(xì)菌恢復(fù)生長要滯后于熱脅迫，可能與細(xì)菌在低溫環(huán)境下生理代謝和繁殖速度減慢有關(guān)。熱脅迫和冷脅迫24 h恢復(fù)生長時(shí)間要滯后于12 h和6 h，這可能與長時(shí)間溫度脅迫，導(dǎo)致部分細(xì)菌死亡或者活性減弱有關(guān)。在溫度脅迫后，重組菌和空載菌的生長后期均超過了37 ℃誘導(dǎo)菌，究其原因，可能是除了重組表達(dá)的HSP16-1對細(xì)菌發(fā)揮應(yīng)激響應(yīng)作用外，細(xì)菌自身的應(yīng)激響應(yīng)基因也在發(fā)揮作用，使得脅迫后細(xì)菌的生長反而好于37 ℃誘導(dǎo)菌。此外，本研究發(fā)現(xiàn)重組菌誘導(dǎo)后的細(xì)菌生長要低于未誘導(dǎo)，可能是由于IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白，對細(xì)菌有一定的毒性作用，輕微抑制了細(xì)菌的生長[20]。

本研究成功建立了粉塵螨HSP16-1原核表達(dá)方法，揭示了粉塵螨HSP16-1在熱脅迫具有應(yīng)激響應(yīng)功能，建立的方法為在蛋白水平研究粉塵螨等其他螨蟲功能基因提供了技術(shù)借鑒。