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        基氏蠊螨的18S rDNA分子鑒定

        2021-04-28 13:36:40李夢珠張?zhí)m香詹雨娟褚凌渺胡婷婷李心玫王嚴(yán)孫恩濤
        熱帶病與寄生蟲學(xué) 2021年2期
        關(guān)鍵詞:核糖體形態(tài)學(xué)變異

        李夢珠,張?zhí)m香,詹雨娟,褚凌渺,胡婷婷,李心玫,王嚴(yán),孫恩濤

        皖南醫(yī)學(xué)院檢驗學(xué)院,安徽 蕪湖 241002

        革螨種類繁多,在自然界中分布廣泛,與人類關(guān)系密切。革螨可叮咬人的皮膚引起皮炎,少數(shù)還可作為媒介傳播疾病,也有一些種類可以用于生物防治[1-5]。目前,革螨種類的鑒定主要依靠形態(tài)學(xué)特征,然而革螨體積微小、形態(tài)相似、近緣種較多,僅依靠形態(tài)學(xué)方法準(zhǔn)確鑒定革螨種類十分困難[6]。

        隨著分子生物學(xué)和DNA鑒定技術(shù)的不斷發(fā)展和完善,利用標(biāo)準(zhǔn)基因片段對物種進行快速準(zhǔn)確鑒定,可作為傳統(tǒng)分類鑒定的有力補充[7]。線粒體基因(COⅠ)、核糖體基因(18S rDNA和28S rDNA)等分子標(biāo)記被廣泛應(yīng)用于螨類的相關(guān)研究[8]。其中,核糖體DNA(rDNA)結(jié)構(gòu)獨特,分子量大小適中,且信息量大,是近緣種鑒別和序列分析的理想標(biāo)志之一[9]。18S rDNA是核糖體DNA的重要組成部分,其不同片段的核苷酸取代率和進化率相對較低,能更好地用于生物體的分類鑒定及系統(tǒng)進化信息的獲得[10]。本研究對革螨股、蠊螨科的基氏蠊螨(Blattisociuskeegani,B.keegani)18S rDNA基因序列進行擴增、測序和分析,建立基氏蠊螨的分子鑒定方法。

        1 材料與方法

        1.1樣本采集、分離和形態(tài)鑒定 2018年12月,自安徽省蕪湖市某儲藏物中采集儲藏物樣本。從采集樣本中初步分離革螨,在光學(xué)顯微鏡下挑取單只成螨制成玻片后,進行形態(tài)學(xué)鑒定[11]。

        1.2DNA提取,PCR擴增、克隆和測序 參考Jia等[12]提取DNA的方法,提取單只螨DNA,將提取的DNA樣本儲存于-20 ℃冰箱中備用。COⅠ基因的擴增引物設(shè)計參考Webster[13],正向引物:5′- GTTTTGGGATATCTCTCATAC-3′,反向引物:5′-GAGCAACAACATAATAAGTATC-3′。18S rDNA基因的擴增引物設(shè)計參考N Okhravi[14],正向引物:5′-GGCGTGCTTAACACATGCAAGTCG-3′,反向引物:5′-GCGGCTGGCACGTAGTTAG-3′。

        PCR反應(yīng)總體積為25 μL,包含2× Taq PCR Mastermix 12.5 μL,上下游引物(5 μmol/L)各1 μL,DNA模板1 μL,加滅菌后的超純水補足。PCR反應(yīng)程序為95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s,48 ℃退火30 s,72 ℃延伸60 s,循環(huán)34次;72 ℃終延伸10 min。取5 μL PCR擴增產(chǎn)物,用1%瓊脂糖凝膠電泳,Marker D 2000為分子參照,電泳結(jié)束后使用凝膠成像儀觀察、拍照檢測。擴增后的18S rDNA序列經(jīng)購自生工生物工程(上海)股份有限公司的T載體PCR產(chǎn)物克隆試劑盒克隆后,送至上海生工生物科技有限公司測序。

        1.3序列分析 將所獲得的COⅠ和18 S rDNA基因序列在Blast中進行相似性比對,結(jié)合NCBI中蠊螨屬的基因序列,使用Clustal X 1.83軟件進行多序列比對。基于MEGA X[15]軟件進行蛋白質(zhì)翻譯、堿基組成和變異位點分析,以Kimura2-parameter模型計算堿基差異度,以鄰接法(Neighbor-Joining,NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

        2 結(jié) 果

        2.1形態(tài)學(xué)和COⅠ基因雙重鑒定 根據(jù)形態(tài)學(xué)特征鑒定,采集到的革螨為革螨股、蠊螨科、蠊螨屬、基氏蠊螨。同時,將獲得的長度為377 bp COⅠ基因中間區(qū)段在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行Blast比對,結(jié)果顯示與基氏蠊螨具有100%的同源性。

        2.2基于18S rDNA分子鑒定方法的建立

        2.2.118S rDNA序列變異位點分析 選取10個基氏蠊螨個體,所獲得的18S rDNA序列長為1 476 bp,基因序列一致,GenBank編號為MH916618。同時,檢索蠊螨屬的18S rDNA 序列,包括Blattisociustarsalis(B.tarsalis)和Blattisociuseverti(B.everti),GenBank編號分別為KM979620和KM979619。使用Clustal X 1.83對3種蠊螨18S rDNA序列進行比對,取一致長度為473 bp的序列。經(jīng) MEGA X軟件分析,473個位點中,共檢測到466個保守位點,7個變異位點,變異位點占所測序列長度的1.48%(圖1)。3種蠊螨18S rDNA序列均無堿基的插入和缺失,其A+T含量平均為60.75%,表現(xiàn)為A/T偏向性(表1)。

        2.2.2相似性分析 基氏蠊螨18S rDNA序列與GenBank中蠊螨屬18S rDNA序列經(jīng)Blast比對顯示,基氏蠊螨(Blattisociuskeegani)與Blattisociustarsalis有98.73%的相似性,與Blattisociuseverti有98.94%的相似性。

        2.2.3系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹顯示基氏蠊螨(Blattisociuskeegani)與Blattisociustarsalis和Blattisociuseverti聚為一支,表明18S rDNA序列可用于基氏蠊螨的分子鑒定(圖2)。

        表1 基氏蠊螨與蠊螨屬18S rDNA堿基組成分析(%)

        圖1 基氏蠊螨與蠊螨屬18S rDNA基因序列比對

        注:*為本研究所獲得的基氏蠊螨序列。

        3 討 論

        革螨作為醫(yī)學(xué)媒介生物,其種類鑒定十分重要[16]。然而,革螨個體微小、生境復(fù)雜、近緣種多,僅依靠形態(tài)學(xué)方法鑒定革螨及其若蟲、幼蟲、卵和殘體的種類存在一定的困難。目前,常用于螨類鑒定的分子標(biāo)記主要包括線粒體基因和核糖體基因[8]。其中,18S rDNA是真核生物染色體上編輯核糖體小亞基的基因,此段序列具有一定的保守性,在螨類的物種鑒定和分類中起到重要作用。劉成倩[17]等根據(jù)18S rRNA基因序列設(shè)計特異性引物,判斷江蘇某蛋雞場發(fā)生的體外寄生蟲感染為雞皮刺螨引起,為探索出適于診斷雞皮刺螨病的方法提供了科學(xué)依據(jù)。王德印[18]在基于核糖體RNA基因?qū)昨姆肿酉到y(tǒng)學(xué)研究中,獲得的18S rDNA部分序列長度為547~550 bp,僅有約4 bp的差異,說明螨類18S rDNA序列高度保守。

        本研究對基氏蠊螨18S rDNA序列進行擴增、測序和分析,并與GenBank中蠊螨屬18S rDNA序列進行比對和分析。結(jié)果表明,3種螨的A+T含量均大于G+C含量,均表現(xiàn)出A/T偏向性。473個堿基位點中共存在7個堿基變異位點,變異位點數(shù)量占該段序列的1.48%,進一步說明螨類18S rDNA序列高度保守。將本實驗所獲得的基氏蠊螨18S rDNA基因序列與GenBank中的蠊螨屬18S rDNA基因序列比較發(fā)現(xiàn),基氏蠊螨與Blattisociustarsalis和Blattisociuseverti分別有98.73%和98.94%的相似性,且進化樹顯示3種蠊螨聚為一支。因此,18S rDNA可用于基氏蠊螨的鑒定,是對基氏蠊螨分子鑒定方法的補充。此外,本研究在數(shù)據(jù)庫中上傳了基氏蠊螨的基因序列,為鑒定蠊螨屬的近緣種提供了參考依據(jù)。

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