李夢珠，張?zhí)m香，詹雨娟，褚凌渺，胡婷婷，李心玫，王嚴(yán)，孫恩濤

皖南醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)學(xué)院，安徽 蕪湖 241002

革螨種類繁多，在自然界中分布廣泛，與人類關(guān)系密切。革螨可叮咬人的皮膚引起皮炎，少數(shù)還可作為媒介傳播疾病，也有一些種類可以用于生物防治[1-5]。目前，革螨種類的鑒定主要依靠形態(tài)學(xué)特征，然而革螨體積微小、形態(tài)相似、近緣種較多，僅依靠形態(tài)學(xué)方法準(zhǔn)確鑒定革螨種類十分困難[6]。

隨著分子生物學(xué)和DNA鑒定技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，利用標(biāo)準(zhǔn)基因片段對(duì)物種進(jìn)行快速準(zhǔn)確鑒定，可作為傳統(tǒng)分類鑒定的有力補(bǔ)充[7]。線粒體基因(COⅠ)、核糖體基因(18S rDNA和28S rDNA)等分子標(biāo)記被廣泛應(yīng)用于螨類的相關(guān)研究[8]。其中，核糖體DNA(rDNA)結(jié)構(gòu)獨(dú)特，分子量大小適中，且信息量大，是近緣種鑒別和序列分析的理想標(biāo)志之一[9]。18S rDNA是核糖體DNA的重要組成部分，其不同片段的核苷酸取代率和進(jìn)化率相對(duì)較低，能更好地用于生物體的分類鑒定及系統(tǒng)進(jìn)化信息的獲得[10]。本研究對(duì)革螨股、蠊螨科的基氏蠊螨(Blattisociuskeegani，B.keegani)18S rDNA基因序列進(jìn)行擴(kuò)增、測序和分析，建立基氏蠊螨的分子鑒定方法。

1 材料與方法

1.1樣本采集、分離和形態(tài)鑒定 2018年12月，自安徽省蕪湖市某儲(chǔ)藏物中采集儲(chǔ)藏物樣本。從采集樣本中初步分離革螨，在光學(xué)顯微鏡下挑取單只成螨制成玻片后，進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定[11]。

1.2DNA提取，PCR擴(kuò)增、克隆和測序 參考Jia等[12]提取DNA的方法，提取單只螨DNA，將提取的DNA樣本儲(chǔ)存于-20 ℃冰箱中備用。COⅠ基因的擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)參考Webster[13]，正向引物：5′- GTTTTGGGATATCTCTCATAC-3′，反向引物：5′-GAGCAACAACATAATAAGTATC-3′。18S rDNA基因的擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)參考N Okhravi[14]，正向引物：5′-GGCGTGCTTAACACATGCAAGTCG-3′，反向引物：5′-GCGGCTGGCACGTAGTTAG-3′。

PCR反應(yīng)總體積為25 μL，包含2× Taq PCR Mastermix 12.5 μL，上下游引物(5 μmol/L)各1 μL，DNA模板1 μL，加滅菌后的超純水補(bǔ)足。PCR反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，48 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，循環(huán)34次；72 ℃終延伸10 min。取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用1%瓊脂糖凝膠電泳，Marker D 2000為分子參照，電泳結(jié)束后使用凝膠成像儀觀察、拍照檢測。擴(kuò)增后的18S rDNA序列經(jīng)購自生工生物工程(上海)股份有限公司的T載體PCR產(chǎn)物克隆試劑盒克隆后，送至上海生工生物科技有限公司測序。

1.3序列分析 將所獲得的COⅠ和18 S rDNA基因序列在Blast中進(jìn)行相似性比對(duì)，結(jié)合NCBI中蠊螨屬的基因序列，使用Clustal X 1.83軟件進(jìn)行多序列比對(duì)。基于MEGA X[15]軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)翻譯、堿基組成和變異位點(diǎn)分析，以Kimura2-parameter模型計(jì)算堿基差異度，以鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié) 果

2.1形態(tài)學(xué)和COⅠ基因雙重鑒定 根據(jù)形態(tài)學(xué)特征鑒定，采集到的革螨為革螨股、蠊螨科、蠊螨屬、基氏蠊螨。同時(shí)，將獲得的長度為377 bp COⅠ基因中間區(qū)段在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast比對(duì)，結(jié)果顯示與基氏蠊螨具有100%的同源性。

2.2基于18S rDNA分子鑒定方法的建立

2.2.118S rDNA序列變異位點(diǎn)分析 選取10個(gè)基氏蠊螨個(gè)體，所獲得的18S rDNA序列長為1 476 bp，基因序列一致，GenBank編號(hào)為MH916618。同時(shí)，檢索蠊螨屬的18S rDNA 序列，包括Blattisociustarsalis(B.tarsalis)和Blattisociuseverti(B.everti)，GenBank編號(hào)分別為KM979620和KM979619。使用Clustal X 1.83對(duì)3種蠊螨18S rDNA序列進(jìn)行比對(duì)，取一致長度為473 bp的序列。經(jīng) MEGA X軟件分析，473個(gè)位點(diǎn)中，共檢測到466個(gè)保守位點(diǎn)，7個(gè)變異位點(diǎn)，變異位點(diǎn)占所測序列長度的1.48%(圖1)。3種蠊螨18S rDNA序列均無堿基的插入和缺失，其A+T含量平均為60.75%，表現(xiàn)為A/T偏向性(表1)。

2.2.2相似性分析 基氏蠊螨18S rDNA序列與GenBank中蠊螨屬18S rDNA序列經(jīng)Blast比對(duì)顯示，基氏蠊螨(Blattisociuskeegani)與Blattisociustarsalis有98.73%的相似性，與Blattisociuseverti有98.94%的相似性。

2.2.3系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹顯示基氏蠊螨(Blattisociuskeegani)與Blattisociustarsalis和Blattisociuseverti聚為一支，表明18S rDNA序列可用于基氏蠊螨的分子鑒定(圖2)。

表1 基氏蠊螨與蠊螨屬18S rDNA堿基組成分析(%)

圖1 基氏蠊螨與蠊螨屬18S rDNA基因序列比對(duì)

注：*為本研究所獲得的基氏蠊螨序列。

3 討 論

革螨作為醫(yī)學(xué)媒介生物，其種類鑒定十分重要[16]。然而，革螨個(gè)體微小、生境復(fù)雜、近緣種多，僅依靠形態(tài)學(xué)方法鑒定革螨及其若蟲、幼蟲、卵和殘?bào)w的種類存在一定的困難。目前，常用于螨類鑒定的分子標(biāo)記主要包括線粒體基因和核糖體基因[8]。其中，18S rDNA是真核生物染色體上編輯核糖體小亞基的基因，此段序列具有一定的保守性，在螨類的物種鑒定和分類中起到重要作用。劉成倩[17]等根據(jù)18S rRNA基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，判斷江蘇某蛋雞場發(fā)生的體外寄生蟲感染為雞皮刺螨引起，為探索出適于診斷雞皮刺螨病的方法提供了科學(xué)依據(jù)。王德印[18]在基于核糖體RNA基因?qū)昨姆肿酉到y(tǒng)學(xué)研究中，獲得的18S rDNA部分序列長度為547～550 bp，僅有約4 bp的差異，說明螨類18S rDNA序列高度保守。

本研究對(duì)基氏蠊螨18S rDNA序列進(jìn)行擴(kuò)增、測序和分析，并與GenBank中蠊螨屬18S rDNA序列進(jìn)行比對(duì)和分析。結(jié)果表明，3種螨的A+T含量均大于G+C含量，均表現(xiàn)出A/T偏向性。473個(gè)堿基位點(diǎn)中共存在7個(gè)堿基變異位點(diǎn)，變異位點(diǎn)數(shù)量占該段序列的1.48%，進(jìn)一步說明螨類18S rDNA序列高度保守。將本實(shí)驗(yàn)所獲得的基氏蠊螨18S rDNA基因序列與GenBank中的蠊螨屬18S rDNA基因序列比較發(fā)現(xiàn)，基氏蠊螨與Blattisociustarsalis和Blattisociuseverti分別有98.73%和98.94%的相似性，且進(jìn)化樹顯示3種蠊螨聚為一支。因此，18S rDNA可用于基氏蠊螨的鑒定，是對(duì)基氏蠊螨分子鑒定方法的補(bǔ)充。此外，本研究在數(shù)據(jù)庫中上傳了基氏蠊螨的基因序列，為鑒定蠊螨屬的近緣種提供了參考依據(jù)。