王芃 何華春 李道偉 孫宏晨 吳立鵬

人牙髓干細胞(human pulp stem cells，hDPSCs)是組織再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點之一[1]。hDPSCs的獲取方便，可以由患者自身牙齒的自體細胞提供。hDPSCs是干細胞，能夠多向分化為成牙本質(zhì)細胞，神經(jīng)源性細胞，脂肪細胞細胞等[2]。由于它們有向成骨分化的能力[3]，可作為骨組織工程中細胞的選擇。

他克莫司FK506是一種強效的免疫抑制劑，廣泛用于實驗和臨床中的預(yù)防移植后的器官排斥和治療自身免疫性疾病[4]。有研究報道，F(xiàn)K506的治療可能會增加骨量，并可能對骨缺損是一種潛在的治療方式[5]。

本研究提出一種由可注射溫敏水凝膠與FK506復(fù)合材料(FK506-TH)制備的生物相容性骨修復(fù)材料。單純應(yīng)用FK506存在半衰期短、價格昂貴、易降解等問題，因此，常需與合適的藥物控釋系統(tǒng)復(fù)合，以保證其在損傷處持續(xù)高效釋放，更好的發(fā)揮促進組織再生的作用。而載有促進組織修復(fù)藥物的水凝膠材料在達到適宜溫度時凝結(jié)成膠狀固體，更具有藥物緩釋性能。在保證FK506藥物正常發(fā)揮功能的同時，增加了可溶性溫敏水凝膠的協(xié)同促進作用，以期獲得具有較大性能空間的材料。長期、持續(xù)、少量的給藥形式，有望在個性化醫(yī)療中得到應(yīng)用。本文旨在探討載FK506可注射溫敏水凝膠(FK506-TH)作為一種有效的骨修復(fù)材料是一種有前景的治療策略。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與設(shè)備

FK506、ALP試劑盒、茜素紅S(Sigma公司，美國)；胎牛血清(FBS)(Gibco公司，美國)；青霉素鏈霉素雙抗溶液(PAA公司，美國)；Cell Counting Kit-8(DOJINDO Laboratories公司，日本)；引物(Takara公司，日本)；酶標(biāo)檢測儀(Bio-TEK公司，美國)；PCR擴增儀(Thermo公司，美國)。

1.2 FK506-TH水凝膠的制備

FK506儲存液的制備：使用電子天平在稱量紙上稱取5 mg FK506粉末，放置于超凈工作臺內(nèi)，紫外燈光照射6 h滅菌處理，將粉末溶于1.22 mL DMSO溶劑中，配置成濃度為5 mmol/L的FK506儲存液，放于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

56%β-甘油磷酸鈉溶液的制備：在稱量紙上稱取4.48 g β-甘油磷酸鈉粉末，放置于超凈工作臺內(nèi)，紫外燈光照射6 h滅菌處理，將粉末溶于8 mL H-DMEM培養(yǎng)基(含10%FBS、1%青霉素、1%鏈霉素)，0.22 μm濾器過濾，放于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

2%殼聚糖鹽酸溶液的制備：在稱量紙上稱取0.8 g CS粉末，放置于超凈工作臺內(nèi)，紫外燈光照射6 h滅菌處理，將粉末溶于40 mL H-DMEM培養(yǎng)基中，磁力攪拌至顆粒完全溶解，濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.0， 0.22 μm濾器過濾，現(xiàn)配現(xiàn)用。

0.5%明膠溶液的制備：在稱量紙上稱取0.05 g明膠粉末，放置于超凈工作臺內(nèi)，紫外燈光照射6 h滅菌處理，將粉末溶于10 mL H-DMEM培養(yǎng)基中， 0.22 μm濾器過濾，放于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

將8 mL β-甘油磷酸鈉溶液逐滴地加入到40 mL 2%殼聚糖鹽酸溶液中，產(chǎn)生絮狀沉淀，再加入1 mL明膠，配置成FK506-TH， 0.22 μm濾器過濾為可注射溫敏水凝膠浸提液。使用過程中，用可注射溫敏水凝膠浸提液將5 mmol/L的FK506稀釋至10、50、100、500、1 000、1 500、2 000 nmol/mL。

1.3 hDPSCs的分離提取及培養(yǎng)方法

收集2018 年12 月～2019 年1 月吉林大學(xué)口腔醫(yī)院18～30 歲志愿者因埋伏阻生而拔除的無病變第三磨牙，酶消化法培養(yǎng)hPDSCs，取生長狀態(tài)良好的第三代hDPSCs以1×105個/孔的密度接種在6 孔板中(2 mL/孔)，設(shè)置實驗分組為空白對照組、可注射溫敏水凝膠組、FK506組、載FK506可注射溫敏水凝膠組。

1.4 FK506-TH的細胞毒性實驗

CCK-8實驗測定FK506-TH浸提液濃度為0、 10、 50、 100、 500、 1 000、 1 500、 2 000 nmol/L對hPDSCs增殖的影響， 平行實驗重復(fù)3 次。

1.5 FK506-TH促進成骨分化實驗

成骨誘導(dǎo)液的制備：可注射溫敏水凝膠浸提液(含10%胎牛血清、50 mg/L抗壞血酸、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、10-8mol/L地塞米松)。

按照上述1.3方法接種細胞，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育。貼壁后換為成骨誘導(dǎo)液，分別誘導(dǎo)3、7、14 d， 每3 d換液，未處理的細胞為陰性對照。采用Real-time PCR檢測ALP、COLI1、Runx2、OCN和OPN表達水平。

1.6 茜素紅染色

按照上述1.3方法接種細胞，在37 ℃、 5% CO2培養(yǎng)箱中孵育。貼壁后換為成骨誘導(dǎo)液，繼續(xù)培養(yǎng)21 d，每3 d換液。

染色方法：染色前去除原培養(yǎng)液，PBS沖洗3 次，用3 mL預(yù)冷的95%乙醇溶液在4 ℃條件下固定1 h，三蒸水沖洗3 次，加入茜素紅S染液3 mL放于4 ℃持續(xù)染色30 min，PBS洗凈浮色，觀察并拍照。

茜素紅染色定量：每孔加入1 mL 10%氯化十六烷基吡啶(10 mmol/L PBS配置，pH為7.0)，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育30 min，吹打混勻后加入96 孔板內(nèi)，使用酶標(biāo)儀在450 nm處測定吸光度，記錄結(jié)果，計算所有復(fù)孔的平均值，平行實驗重復(fù)3 次。

1.7 堿性磷酸酶染色

按照上述1.3方法接種細胞，在37 ℃、 5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。貼壁后換為成骨誘導(dǎo)液，繼續(xù)培養(yǎng)7 d，每3 d換液。

染色方法：ALP固定液(檸檬酸-丙酮-甲醛固定液)預(yù)熱至26 ℃，固定細胞30 s，去離子水輕輕沖洗45 s， 37 ℃ ALP染色液避光染色15 min，去除染液，去離子水沖洗2 min，蘇木精染液復(fù)染2 min，自來水洗凈浮色，觀察并拍照。

ALP染色定量：培養(yǎng)7 d后，酶消化法收集細胞，裂解細胞，收集上清液并與堿性磷酸酶測定混合，使用酶標(biāo)儀在405 nm處測定吸光度，記錄結(jié)果，計算所有復(fù)孔的平均值，平行實驗重復(fù)3 次。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 FK506-TH適宜濃度的選擇

單純水凝膠(0 nmol/L)能明顯促進hDPSCs增殖(P<0.001)，濃度(10、50、100、500、1 000、1 500、2 000 nmol/L)的載FK506可注射溫敏水凝膠浸提液均可促進細胞增殖(P<0.05)。當(dāng)濃度為500 nmol/L時促進細胞增殖的作用更明顯(P<0.01)(圖 1)。因此，選擇500 nmol/L濃度的載FK506可注射溫敏水凝膠浸提液用于后續(xù)檢測促成骨分化能力的實驗。

圖 1 FK506-TH浸提液對 hDPSCs增殖的影響(*: P<0.5,**: P<0.1, ***: P<0.01)

2.2 FK506-TH對成骨相關(guān)基因表達的影響

圖 2顯示，在hDPSCs培養(yǎng)體系中成骨誘導(dǎo)3 d后，與空白對照組相比，單純FK506組和FK506-TH組成骨相關(guān)基因ALP、COLI1、Runx2、OCN、OPN的表達均上調(diào)(P<0.05)，F(xiàn)K506-TH組Runx2、OPN的表達上調(diào)更明顯(P<0.01)。相對于單純FK506組，F(xiàn)K506-TH組ALP、COLI1、Runx2的表達明顯上調(diào)(P<0.01)，OCN、OPN的表達上調(diào)不明顯(P<0.05)。加入藥物7 d后，與空白對照組相比，單純FK506組和FK506-TH組ALP、COLI1、Runx2、OCN、OPN的表達均上調(diào)(P<0.01)，F(xiàn)K506-TH組ALP、COLI1、OCN的表達上調(diào)更明顯(P<0.001)。FK506-TH組ALP、COLI1、OCN和OPN的表達均高于單純FK506組(P<0.05)，其中Runx2的表達明顯上調(diào)(P<0.01)。加入藥物14 d后，與空白對照組相比，單純FK506組和FK506-TH組ALP、COLI1、Runx2、OCN、OPN的表達均上調(diào)(P<0.01)，F(xiàn)K506-TH組ALP的表達上調(diào)更明顯(P<0.001)。FK506-TH組相對于單純FK506組，ALP的表達上調(diào)不明顯(P<0.05)，而COLI1、Runx2、OCN、OPN的表達顯著提高(P<0.001)。

2.3 茜素紅染色和定量

成骨誘導(dǎo)21 d，茜素紅染色顯示，空白對照組與單純水凝膠組、FK506組、FK506-TH組3 組，均可見鮮紅色鈣化結(jié)節(jié)，且與空白對照組相比，其余3 組形成的鈣結(jié)節(jié)明顯多于空白對照組，其中FK506-TH組鈣化結(jié)節(jié)形成更多(P<0.001)(圖 3～4)。

2.4 堿性磷酸酶染色和定量

誘導(dǎo)7 d后，ALP染色顯示，空白對照組與單純水凝膠組、FK506組、FK506-TH組3 組，均可見細胞核呈藍色，且與空白對照組相比，其余3 組較空白對照組染色細胞多，其中FK506-TH處理的細胞中，更多的ALP細胞簇呈陽性(P<0.001)。

圖 3 FK506-TH浸提液對hDPSCs礦化能力的影響

圖 4 FK506-TH浸提液對hDPSCs ALP活性的影響

3 討 論

FK506是鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制劑，鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶是一種參與NFAT活化的酶。NFATc1是神經(jīng)鈣蛋白的下游底物，在T細胞活化時表達強烈[6]。NFATc1又是破骨細胞生成所必需的[7]。破骨細胞是多核的、骨吸收細胞，在骨重建和鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)中是必不可少的[8]。已有學(xué)者提出，F(xiàn)K506可以通過體外靶向鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶-NFAT途徑抑制破骨細胞形成[9]。研究結(jié)果的復(fù)雜性表明，對破骨細胞的抑制作用只是藥物對骨影響的一個部分，成骨細胞也表達鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶。有研究報道，鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶在調(diào)節(jié)成骨細胞的起源和功能中發(fā)揮作用[10]。FK506可以促進成骨細胞的轉(zhuǎn)錄因子的表達，包括Runx2、OPN和OCN[11]。水凝膠具有一定的力學(xué)性能，非常適合藥物和細胞的局部植入[12]，也能形成三維水凝膠結(jié)構(gòu)與適應(yīng)的網(wǎng)格大小，以促進藥物傳遞和細胞移植[13]。

為了明確FK506-TH對體外成骨細胞分化及成熟的作用，本研究通過酶解法提取hDPSCs，并分別在可注射溫敏水凝膠、FK506、FK506-TH 3 種條件下探究不同藥物對hDPSCs的影響。首先，細胞毒性實驗表明，支架材料可注射溫敏水凝膠及FK506-TH(0～2 000 nmol/L濃度)無細胞毒性，在體外易于hDPSCs的附著和增殖，具有良好的生物相容性，二者的協(xié)同促進作用使他們成為再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的理想材料。RT-PCR顯示成骨誘導(dǎo)3 d時，F(xiàn)K506-TH作用后，ALP表達水平上調(diào)顯著，ALP是成骨分化早期的基因，表明成骨細胞活性高。COLI1和Runx2骨形成標(biāo)志物的顯著增加可以表明培養(yǎng)基中含有較高的骨基質(zhì)。成骨誘導(dǎo)7 d時，Runx2得表達顯著增加，說明hDPSCs有較高的成骨活性，Runx2是成骨分化過程中的關(guān)鍵基因，在成骨分化的各個時期均發(fā)揮重要的調(diào)控作用。14 d時，ALP的表達上調(diào)不明顯，可能受多種因子的影響，在本實驗中不能明確FK506-TH對ALP的作用。而COLI1、Runx2、OCN、OPN的表達顯著提高，OCN和OPN的含量高代表已形成了成熟骨基質(zhì)。綜合以上RT-PCR結(jié)果分析，F(xiàn)K506-TH在成骨分化各期均可明顯促進成骨相關(guān)基因的表達，因而證實FK506-TH可以發(fā)揮一定的促成骨作用，并且相對于單純FK506藥物，其促成骨作用更強。為了進一步驗證RT-PCR的結(jié)論，本實驗同時進行了茜素紅鈣結(jié)節(jié)染色和堿性磷酸酶活性檢測。二者的結(jié)果均證實：可注射溫敏水凝膠、FK506、FK506-TH均可促進hDPSCs分化和礦化，且FK506-TH顯示出更強的促成骨分化能力。其臨床應(yīng)用價值有待體內(nèi)實驗進一步研究。