?？″| 侯俊清 朱朝陽 李曉東 李鐵強(qiáng) 徐衛(wèi)波 趙小磊 徐文超

膀胱癌(bladder cancer，BC)是全世界最常見的泌尿科惡性腫瘤之一[1-2]。盡管膀胱癌患者接受了根治性膀胱切除術(shù)、放射療法以及術(shù)后化學(xué)或免疫療法，但他們的預(yù)后仍然很差[3]。由于高復(fù)發(fā)率和死亡率，迫切需要尋找用于診斷治療膀胱癌的新型分子生物標(biāo)志物。長非編碼RNA(long non-coding RNAs，lncRNAs)是一種內(nèi)源RNA，長度超過200 nt，無開放閱讀框(open reading frames，ORF)，因而lncRNAs無法編碼蛋白質(zhì)，只能調(diào)節(jié)基因的表達(dá)[4]。越來越多的證據(jù)表明，lncRNAs參與了多種人類癌癥的發(fā)生和發(fā)展[5-7]。此外，lncRNAs可能是包括膀胱癌在內(nèi)許多癌癥診斷和預(yù)后的潛在治療靶點和生物標(biāo)志物[8-10]。鋅指蛋白多型2反義RNA 1(Zinc finger protein multitype 2 antisense RNA 1，ZFPM2-AS1)是位于8號染色體上的一種lncRNA[11]。Yan等[12]揭示了ZFPM2-AS1與肝細(xì)胞癌的進(jìn)展有關(guān)。Kong等[13]研究表明ZFPM2-AS1通過抑制p53途徑促進(jìn)胃癌進(jìn)展。然而，ZFPM2-AS1在膀胱癌中的表達(dá)和作用尚未闡明。本研究將通過研究lncRNA ZFPM2-AS1在膀胱癌中的表達(dá)及其對膀胱癌細(xì)胞T24增殖、克隆形成、遷移和侵襲的影響，進(jìn)一步揭示膀胱癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，以期為膀胱癌診斷治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 胎牛血清、F12K、RPMI-1640、DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基購自美國 Hyclone 公司；lncRNA ZFPM2-AS1引物、siRNA購自上海吉瑪生物制藥有限公司；Trizol、Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、2×SYBR Green Real time PCR Master Mix購自寶生物工程(大連)有限公司；放射免疫沉淀法(radio-immunoprecipitation assay，RIPA)裂解液、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量試劑盒、MTT試劑盒、GAPDH抗體購自碧云天生物技術(shù)公司；Transwell小室購自美國康寧公司；p-β-catenin、β-catenin、c-Myc、Cyclin D1購自美國 abcam公司，二抗購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 一般資料 收集2017年5月至2019年5月河南大學(xué)淮河醫(yī)院泌尿外科行手術(shù)切除治療的膀胱癌患者癌組織和癌旁組織樣本共102例，其中患者男性80例，女性22例；年齡32～76歲，平均年齡(43.7±17.1)歲；TNM分期Ⅰ～Ⅲ期42例，Ⅳ期60例。所有樣品在采集后立即冷凍保存在-80 ℃處，并經(jīng)至少兩名病理醫(yī)生診斷為膀胱癌組織。所有患者術(shù)前未接受任何治療，都清楚地知道這些樣本將在將來使用，然后簽署知情同意書。本研究經(jīng)倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 正常膀胱上皮細(xì)胞SV-HUC-1購自美國ATCC公司；膀胱癌細(xì)胞T24、J82和5637購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫；SV-HUC-1細(xì)胞用含10%胎牛血清的F12K培養(yǎng)基培養(yǎng)，5637用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，T24和J82細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，所有細(xì)胞均置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長期T24細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)50%時，將3.3 μl的Lipofectmine 2000和陰性對照siRNA、lncRNA ZFPM2-AS1 siRNA兩種干擾序列與250 μl Opti-MEM混勻，室溫孵育15 min后加入細(xì)胞中，分別記為沉默對照組、沉默ZFPM2-AS1組，培養(yǎng)6 h后更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至48 h后進(jìn)行后續(xù)實驗研究。

1.2.3 qPCR檢測 利用TRIzol試劑盒提取膀胱癌組織樣本和細(xì)胞中總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，2×SYBR Green Real time PCR Master Mix試劑盒檢測lncRNA ZFPM2-AS1表達(dá)，以GAPDH為內(nèi)參。lncRNA ZFPM2-AS1正向引物：5'-CTA CTG CAG TGG GAG GCA AA-3'，反向引物:5'-AGG GGC ATT TAC CAC TGT GTG-3'；GAPDH正向引物：5'-TAT GAT GAT ATC AAG AGG GTA GT-3'，反向引物5'-TGT ATC CAA ACT CAT TGT CAT-3'。

1.2.4 細(xì)胞增殖檢測 取對數(shù)生長期各組T24細(xì)胞分別接種于96孔板中，密度為4×103個/孔，細(xì)胞培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后，每孔加入20 μl 5 mg/ml的MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h，然后棄去上清液，每孔加入150 μl 二甲基亞砜，酶標(biāo)儀震蕩10 min以溶解結(jié)晶并檢測490 nm處各孔吸光值。

1.2.5 細(xì)胞克隆形成實驗 取對數(shù)生長期各組T24細(xì)胞分別接種于6孔板中，密度為1×103個/孔，培養(yǎng)過程中每72 h更換一次培養(yǎng)基，培養(yǎng)12 d后，用甲醇固定細(xì)胞，結(jié)晶紫染色，顯微鏡下觀察并拍照，計數(shù)含有大于50個細(xì)胞的克隆數(shù)。

1.2.6 細(xì)胞劃痕實驗 取對數(shù)生長期各組T24細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)過夜待細(xì)胞融合度達(dá)到90%時，用無菌200 μl槍頭進(jìn)行劃痕，后吸棄上清，PBS洗去漂浮細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)基并在顯微鏡下拍照，此時記為0 h，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后取出拍照，此時記為48 h。劃痕閉合率=(0 h劃痕寬度-48 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。

1.2.7 細(xì)胞侵襲實驗 取預(yù)鋪基質(zhì)膠的Transwell小室置于24孔板中，每孔加入50 μl無血清培養(yǎng)基潤化30 min，后取2組5×104個對數(shù)生長期T24細(xì)胞接種至上室中，下室中加600 μl完全培養(yǎng)基，每組設(shè)置3個復(fù)孔。培養(yǎng)48 h后，棄上清，PBS洗滌2次，用甲醇固定細(xì)胞，結(jié)晶紫染色，顯微鏡下觀察并拍照，計數(shù)各組侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.2.8 Western blot檢測 RIPA裂解液提取2組對數(shù)生長期T24細(xì)胞總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，取適量蛋白用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel-electrophoresis，SDS-PAGE)電泳分離并轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別用β-catenin、p-β-catenin、c-Myc、Cyclin D1和GAPDH一抗稀釋液于4 ℃孵育過夜，TBST洗滌后，二抗稀釋液室溫孵育2 h，后經(jīng)TBST洗滌后用ECL發(fā)光液孵育條帶并置于化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中進(jìn)行曝光顯影，Image J軟件分析各個蛋白的相對表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 膀胱癌組織及膀胱癌細(xì)胞中l(wèi)ncRNA ZFPM2-AS1的表達(dá)

qPCR檢測102對膀胱癌組織樣本和膀胱癌細(xì)胞系中l(wèi)ncRNA ZFPM2-AS1表達(dá)結(jié)果顯示，膀胱癌組織中l(wèi)ncRNA ZFPM2-AS1表達(dá)(4.92±3.85)高于癌旁組織(1.83±1.29)，膀胱癌細(xì)胞T24、J82和5637細(xì)胞中l(wèi)ncRNA ZFPM2-AS1表達(dá)(5.92±0.62、3.02±0.34、4.85±0.61)高于正常膀胱上皮細(xì)胞(1.02±0.10)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=7.686、13.514、9.775、10.732，P<0.01)。

2.2 沉默T24細(xì)胞中l(wèi)ncRNA ZFPM2-AS1的表達(dá)

qPCR檢測結(jié)果顯示，沉默ZFPM2-AS1組T24細(xì)胞中l(wèi)ncRNA ZFPM2-AS1表達(dá)水平(0.14±0.02)低于沉默對照組(0.98±0.09)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=15.781，P=0.003)。

2.3 沉默lncRNA ZFPM2-AS1對膀胱癌細(xì)胞T24增殖的影響

MTT檢測結(jié)果顯示，48、72 h時沉默ZFPM2-AS1組T24細(xì)胞相對吸光度值較沉默對照組顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，表明沉默lncRNA ZFPM2-AS1可顯著抑制膀胱癌細(xì)胞T24增殖。見表1。

表1 沉默lncRNA ZFPM2-AS1后T24細(xì)胞相對吸光度值變化

2.4 沉默lncRNA ZFPM2-AS1對膀胱癌細(xì)胞T24克隆形成的影響

沉默ZFPM2-AS1組T24細(xì)胞克隆數(shù)(97.54±19.64)較沉默對照組(257.57±46.25)明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.516，P=0.015)。見圖1。

圖1 沉默lncRNA ZFPM2-AS1抑制T24細(xì)胞克隆形成

2.5 沉默lncRNA ZFPM2-AS1對膀胱癌細(xì)胞T24遷移的影響

沉默ZFPM2-AS1組T24細(xì)胞劃痕閉合率[(33.19±3.89)%]較沉默對照組[(61.35±6.87)%]明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=6.178，P=0.007)。見圖2。

圖2 沉默lncRNA ZFPM2-AS1抑制T24細(xì)胞遷移(×100)

2.6 沉默lncRNA ZFPM2-AS1對膀胱癌細(xì)胞T24遷移的影響

沉默ZFPM2-AS1組T24細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)(41.43±9.85)較沉默對照組(152.39±15.71)明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=10.365，P=0.001)。見圖3。

圖3 沉默lncRNA ZFPM2-AS1抑制T24細(xì)胞侵襲(×100)

2.7 沉默lncRNA ZFPM2-AS1對膀胱癌細(xì)胞T24中Wnt/β-catenin信號通路的影響

沉默對照組T24細(xì)胞中p-β-catenin、β-catenin及其下游蛋白c-Myc和Cyclin D1蛋白相對表達(dá)量分別為0.48±0.05、1.14±0.11、0.68±0.07和0.56±0.06；沉默ZFPM2-AS1組T24細(xì)胞中p-β-catenin、β-catenin、c-Myc和Cyclin D1蛋白相對表達(dá)量分別為1.18±0.13、0.44±0.05、0.24±0.02和0.36±0.04。與沉默對照組比較，沉默ZFPM2-AS1組T24細(xì)胞中β-catenin、c-Myc和Cyclin D1表達(dá)明顯降低，p-β-catenin蛋白表達(dá)顯著增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=10.034、10.468、4.804、8.705，P<0.01)。見圖 4。

圖4 Western blot檢測沉默lncRNA ZFPM2-AS1后T24細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號通路蛋白表達(dá)

3 討論

膀胱癌是全世界泌尿系統(tǒng)常見的癌癥之一[14]。據(jù)2015年中國癌癥統(tǒng)計顯示，膀胱癌的死亡率和發(fā)病率在泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤中排名第一，診斷出約80500例新病例，并導(dǎo)致約32900例死亡[15]。與前列腺癌不同，膀胱癌仍然缺乏可靠的腫瘤生物標(biāo)志物[16]。即使進(jìn)行全身治療，仍有高達(dá)45%的膀胱癌患者會復(fù)發(fā)，并且膀胱癌的5年生存率還不到50%[1,17]。因此，有必要發(fā)現(xiàn)新的分子生物學(xué)標(biāo)志物來預(yù)測臨床進(jìn)展和不良預(yù)后，并闡明膀胱癌發(fā)展和進(jìn)展的分子機(jī)制以開發(fā)新的治療靶標(biāo)。

長非編碼RNA(lncRNA)的研究進(jìn)展可能為癌癥研究人員提供新的思路。lncRNA是無法翻譯成蛋白質(zhì)的一組RNA，lncRNA占轉(zhuǎn)錄組的98%以上，與細(xì)胞的一系列生物學(xué)功能密切相關(guān)[18-19]。研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA的失調(diào)與各種癌癥的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。例如，有研究發(fā)現(xiàn)TINCR可抑制肺癌細(xì)胞增殖和侵襲；MCM3AP-AS1可促進(jìn)肝細(xì)胞癌進(jìn)展，此外，ZFAS1可以促進(jìn)膀胱癌的發(fā)生[20-22]。ZFPM2-AS1是一種尚未引起廣泛關(guān)注的新型lncRNA。最近的一項研究證明，ZFPM2-AS1可通過減弱p53途徑促進(jìn)胃癌的進(jìn)展[13]。lncRNA ZFPM2-AS1可作為ceRNA通過調(diào)控miR-18b-5p/VMA21和miR-511-3p/AFF4通路參與肺腺癌進(jìn)展[23-24]。此外，Liu等研究表明，ZFPM2-AS1在腎細(xì)胞癌標(biāo)本和細(xì)胞中明顯上調(diào)，且與腎癌患者的腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)；過表達(dá)ZFPM2-AS1可顯著促進(jìn)腎癌細(xì)胞生長、遷移和侵襲[25]。上述結(jié)果表明，ZFPM2-AS1促進(jìn)了多種腫瘤發(fā)生進(jìn)展，可能是癌基因，然而，其在膀胱癌中的表達(dá)和作用仍不清楚。本研究通過qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，lncRNA ZFPM2-AS1在膀胱癌組織和細(xì)胞中高表達(dá)，沉默其表達(dá)能夠顯著抑制膀胱癌細(xì)胞增殖、克隆形成、遷移和侵襲，提示lncRNA ZFPM2-AS1在膀胱癌中是一個潛在的致癌基因。

Wnt/β-catenin信號通路是人類腫瘤中最常見的致癌信號通路之一[26]。據(jù)報道，一些lncRNAs在包括膀胱癌在內(nèi)的多種癌癥中可調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)。例如，長鏈非編碼RNA XIST通過調(diào)節(jié)miR-139-5p介導(dǎo)的Wnt/β-catenin信號通路來促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移[27]。本研究發(fā)現(xiàn)，沉默lncRNA ZFPM2-AS1可顯著抑制膀胱癌細(xì)胞T24中Wnt/β-catenin信號通路蛋白β-catenin及其下游蛋白c-Myc和Cyclin D1表達(dá)，上調(diào)p-β-catenin表達(dá)，表明lncRNA ZFPM2-AS1通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)途徑的激活在膀胱癌細(xì)胞中發(fā)揮致癌作用。

綜上所述，LncRNA ZFPM2-AS1在膀胱癌中高表達(dá)，沉默其表達(dá)能夠抑制膀胱癌細(xì)胞增殖、克隆形成、遷移和侵襲，其機(jī)制可能與抑制Wnt/β-catenin信號通路有關(guān)，提示lncRNA ZFPM2-AS1可能作為膀胱癌患者的新型潛在治療靶標(biāo)和預(yù)后生物標(biāo)志物。