田月如， 王晶晶， 艾芙琪， 馬逸珉， 王 蓓， 蔣曉飛

（復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200040）

近年來，多重耐藥菌的出現(xiàn)已成為臨床抗感染治療面臨的挑戰(zhàn)[1-3]，如何通過準(zhǔn)確、可靠的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)及時指導(dǎo)臨床合理使用抗菌藥物，成為臨床微生物實(shí)驗(yàn)室工作的重點(diǎn)。微量肉湯稀釋法（broth microdilution method，BMM）可提供準(zhǔn)確、可靠的抗菌藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果，但其需要手工操作，耗時較長、操作復(fù)雜，不能完全滿足臨床需求。商品化全自動藥敏卡操作簡便，但抗菌藥物覆蓋種類不足，易出現(xiàn)全耐藥譜。法國生物梅里埃公司針對中國的細(xì)菌耐藥情況制定了Vitek 2 compact自動化藥敏分析系統(tǒng)配套使用的AST-N334、AST-N335和AST-P639中國定制藥敏卡。AST-N334和AST-N335應(yīng)用于革蘭陰性菌的藥物敏感性試驗(yàn)，在原有基礎(chǔ)上刪除了氨芐西林、氨芐西林-舒巴坦、一代和二代頭孢菌素、慶大霉素和呋喃妥因，增加了替加環(huán)素、多黏菌素、頭孢哌酮-舒巴坦、多西環(huán)素和米諾環(huán)素；AST-P639應(yīng)用于葡萄球菌、腸球菌和無乳鏈球菌的藥物敏感性試驗(yàn)，在原有基礎(chǔ)上刪除了四環(huán)素和呋喃妥因，增加了頭孢洛林。為評估上述中國定制藥敏卡的可靠性，本研究以權(quán)威機(jī)構(gòu)提供的室間質(zhì)量評價菌株為檢測對象，采用AST-N334、AST-N335、AST-P639藥敏卡及BMM進(jìn)行平行試驗(yàn)，以室間質(zhì)量評價結(jié)果為參考標(biāo)準(zhǔn)，評估3種中國定制藥敏卡和BMM的準(zhǔn)確性；以臨床分離株為檢測對象，以BMM結(jié)果為參考標(biāo)準(zhǔn)，評估中國定制藥敏卡的準(zhǔn)確性。

1 材料和方法

1.1 菌株來源

隨機(jī)收集2005—2017年美國病理學(xué)家協(xié)會（the College of American Pathologists，CAP）、我國國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗(yàn)中心、上海市臨床檢驗(yàn)中心室間質(zhì)量評價菌株73株，其中革蘭陰性菌43株（CAP來源16株、國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗(yàn)中心來源14株，上海市臨床檢驗(yàn)中心來源13株）、革蘭陽性菌30株（CAP來源10株、國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗(yàn)中心來源6株、上海市臨床檢驗(yàn)中心來源14株）。另收集2018年1—6月華山醫(yī)院住院患者首次臨床分離株112株。見表1。

表1 菌株構(gòu)成 株

質(zhì)控菌株大腸埃希菌（ATCC 25922）、銅綠假單胞菌（ATCC 27853）、大腸埃希菌（ATCC 35218）、肺炎克雷伯菌（ATCC 700603）、金黃色葡萄球菌（ATCC 29213）、糞腸球菌（ATCC 29212）、糞腸球菌（ATCC 51299）為抗菌藥物敏感性試驗(yàn)質(zhì)控菌株，購自上海市臨床檢驗(yàn)中心。

1.2 體外藥物敏感性試驗(yàn)

腸桿菌科、不動桿菌選用美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）推薦的BMM藥敏板（溫州康泰生物科技有限公司）和AST-N334、AST-N335藥敏板，非發(fā)酵菌選用BMM藥敏株和AST-N335藥敏板，葡萄球菌和腸球菌選用BMM藥敏株、AST-P639藥敏卡進(jìn)行抗菌藥物敏感性試驗(yàn)。BMM每個試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值?？咕幬锓N類見表2～表5。

BMM質(zhì)控采用大腸埃希菌（ATCC 25922）、金黃色葡萄球菌（ATCC 29213）、大腸埃希菌（ATCC 35218）、肺炎克雷伯菌（ATCC 700603）進(jìn)行。AST-N334、AST-N335藥敏卡質(zhì)控采用大腸埃希菌（ATCC 25922）、大腸埃希菌（ATCC 35218）、銅綠假單胞菌（ATCC 27853）進(jìn)行；AST-P639藥敏卡質(zhì)控采用金黃色葡萄球菌（ATCC 29213）、糞腸球菌（ATCC 29212、ATCC 51299）進(jìn)行。BMM按照2018年CLSI推薦的方法[4]進(jìn)行操作。藥敏卡參照說明書進(jìn)行操作。替加環(huán)素和多黏菌素根據(jù)歐州藥物敏感性試驗(yàn)委員會（European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing，EUCAST）2012版標(biāo)準(zhǔn)判斷結(jié)果[5]，其他藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果根據(jù)CLSI 2018年推薦標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷[4]。

準(zhǔn)確性評估：以室間質(zhì)量評價菌株為檢測對象，以評價機(jī)構(gòu)提供的分類結(jié)果為參考標(biāo)準(zhǔn)，評估藥敏卡及BMM的準(zhǔn)確性及可靠性。由于室間質(zhì)量評價只提供了耐藥/中介/敏感分類結(jié)果，沒有提供具體最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）或紙片擴(kuò)散法檢測結(jié)果，本研究只評估了藥敏卡及BMM的分類一致率（categorical agreement，CA）。對于評價機(jī)構(gòu)沒有提供分類結(jié)果的室間質(zhì)量評價菌株和臨床分離菌株，以BMM結(jié)果為參考標(biāo)準(zhǔn)來評價藥敏卡的準(zhǔn)確性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用WHONET 5.6軟件對BMM藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果和藥敏卡藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。

2 結(jié)果

2.1 中國定制藥敏卡、BMM的準(zhǔn)確性和可靠性

以室間質(zhì)量評價菌株為檢測對象，以室間質(zhì)量評價分類結(jié)果為參考標(biāo)準(zhǔn)，評估3種中國定制藥敏卡及BMM的準(zhǔn)確性和可靠性。

2.1.1 革蘭陰性菌 AST-N334的CA為95.5%（126/132），重大錯誤（major error，ME）率占1.5%（2/132），分別出現(xiàn)在亞胺培南和復(fù)方磺胺甲噁唑；微小錯誤（minor error，MIE）率占3%（4/126），分別出現(xiàn)在頭孢他啶、頭孢西丁、亞胺培南和左氧氟沙星。AST-N335的CA為96.8%（179/185），ME占1.6%（3/185），分別出現(xiàn)在左氧氟沙星、哌拉西林-他唑巴坦和復(fù)方磺胺甲噁唑；MIE占1.6%（3/185），分別出現(xiàn)在頭孢他啶和頭孢吡肟。BMM的CA為95.0%（229/241），ME占0.8%（2/241）（分別出現(xiàn)在阿米卡星和頭孢他啶），MIE占4.2%（10/241）（分別出現(xiàn)在阿米卡星、氨曲南、哌拉西林-他唑巴坦和氨芐西林-舒巴坦）。見表2。

表2 中國定制藥敏卡和BMM革蘭陰性菌檢測準(zhǔn)確率（以權(quán)威機(jī)構(gòu)結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)）

2.1.2 革蘭陽性菌 AST-P639的CA為99.5%（182/183），MIE為0.5%（1/183），出現(xiàn)在慶大霉素。BMM的CA為100.0%（183/183）。見表3。

表3 中國定制藥敏卡和BMM革蘭陽性菌檢測準(zhǔn)確率（以權(quán)威機(jī)構(gòu)結(jié)果為參考標(biāo)準(zhǔn)）

2.2 中國定制藥敏卡的準(zhǔn)確性

2.2.1 革蘭陰性菌 AST-N334標(biāo)準(zhǔn)一致率（essential agreement，EA）為88.4%（961/1 087），CA為94.6%（903/955），非常重大錯誤（very major error，VME）占0.3%（3/955），分別出現(xiàn)在頭孢他啶、頭孢吡肟和亞胺培南；ME占1.9%（18/955），分別出現(xiàn)在頭孢曲松、頭孢西丁、哌拉西林-他唑巴坦和替加環(huán)素；MIE占3.2%（31/955），分別出現(xiàn)在阿米卡星、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢吡肟、頭孢西丁、亞胺培南、厄他培南、左氧氟沙星、哌拉西林-他唑巴坦和替加環(huán)素。AST-N335 EA為89.9%（1 388/1 544），CA為95.1%（1 414/1 487），VME占0.3%（5/1 487），分別出現(xiàn)在頭孢他啶、頭孢吡肟、米諾環(huán)素和妥布霉素；ME占0.8%（12/1 487），分別出現(xiàn)在美羅培南、多西環(huán)素、米諾環(huán)素和妥布霉素；MIE占3.8%（56/1 487），分別出現(xiàn)在阿米卡星、頭孢他啶、頭孢吡肟、亞胺培南、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、哌拉西林-他唑巴坦、替加環(huán)素、多西環(huán)素、米諾環(huán)素、妥布霉素和氨曲南。見表4。

表4 中國定制藥敏卡革蘭陰性菌檢測準(zhǔn)確率（以BMM結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)）

2.2.2 革蘭陽性菌 AST-P639 EA為95.4%（541/567），CA為98.7%（389/394），ME占0.5%（2/394），分別出現(xiàn)在青霉素和復(fù)方磺胺甲噁唑；MIE占0.8%（3/394），分別出現(xiàn)在慶大霉素和莫西沙星。見表5。

表5 AST-P639革蘭陽性菌檢測準(zhǔn)確率（以BMM結(jié)果為參考標(biāo)準(zhǔn)）

續(xù)表5

3 討論

MIC在抗菌藥物使用中具有重要意義。隨著自動化檢測的普及，越來越多的臨床實(shí)驗(yàn)室采用商品化全自動藥敏分析系統(tǒng)，因此評價方法的準(zhǔn)確性十分重要。為了評估中國定制藥敏卡的可靠性，本研究以權(quán)威機(jī)構(gòu)室間質(zhì)量評價菌株為檢測對象，以室間質(zhì)量評價結(jié)果為參考標(biāo)準(zhǔn)評價中國定制藥敏卡的檢測準(zhǔn)確率，結(jié)果顯示，AST-N334、AST-N335、AST-P639的CA分別為95.5%（126/132）、96.8%（179/185）、99.5%（182/183），提示中國定制藥敏卡檢測準(zhǔn)確率高，具有良好的臨床應(yīng)用可信度。

有學(xué)者對Vitek 2 Compact自動化藥敏分析系統(tǒng)進(jìn)行性能評估，但其參考方法為E試驗(yàn)[6-7]和紙片擴(kuò)散法[8]，而不是CLSI推薦的BMM。本研究以BMM結(jié)果為參考標(biāo)準(zhǔn)，對權(quán)威評價機(jī)構(gòu)未提供分類結(jié)果的室間質(zhì)量評價菌株和臨床分離菌株的藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行準(zhǔn)確性評價。然而，BMM由于藥物稱量、手工加樣、肉眼判斷上的細(xì)小差異，易出現(xiàn)批內(nèi)、批間誤差。為此，本研究BMM采用檢測3次取均值的辦法來避免此類誤差，并采用室間質(zhì)量評價菌株及其標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果對BMM結(jié)果進(jìn)行可靠性評估，結(jié)果顯示BMM檢測革蘭陰性菌、革蘭陽性菌的CA分別為95.0%、100.0%，提示BMM的藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性高，誤差在允許范圍內(nèi)。

本研究以BMM結(jié)果為參考標(biāo)準(zhǔn)，對臨床分離株耐藥多樣性檢測結(jié)果進(jìn)行評價，結(jié)果顯示，中國定制藥敏卡的CA高于EA，AST-N334、 AST-N335檢測準(zhǔn)確率相當(dāng)。AST-N334的EA為88.4%，CA為94.6%；AST-N335的EA為89.9%，CA為95.1%；AST-P639的EA為95.4%，CA為98.7%。AST-N334、AST-N335檢測臨床常用抗菌藥物亞胺培南的CA分別為95.9%、96.0%，檢測美羅培南、厄他培南、多黏菌素E的CA分別為99.2%、98.6%、100.0%；AST-P639檢測葡萄球菌耐甲氧西林、萬古霉素、利奈唑胺、替加環(huán)素的CA均為100.0%。提示中國定制藥敏卡在檢測菌株耐藥多樣性方面也具有較高的準(zhǔn)確性。

本研究比較了質(zhì)控菌株和臨床分離株3種中國定制藥敏卡藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)AST-N334、AST-N335和AST-P639檢測質(zhì)控菌株的CA分別為95.5%、96.8%、99.5%，檢測臨床分離株的CA分別為94.6%、95.1%、98.7%，準(zhǔn)確率均很高，檢測質(zhì)控菌株的CA略高于臨床分離株。AST-N334結(jié)果的差異體現(xiàn)在頭孢曲松、頭孢吡肟、哌拉西林-他唑巴坦；AST-N335結(jié)果的差異體現(xiàn)在頭孢他啶、頭孢吡肟、米諾環(huán)素和妥布霉素；AST-P639結(jié)果基本一致，差異主要集中在MIE，原因在于質(zhì)控菌株結(jié)果總誤差來源于人為操作和檢測MIC值與真實(shí)MIC值之間的誤差，而臨床分離株結(jié)果總誤差除上述2種誤差外，還有臨床分離株耐藥多樣性引起的誤差。但質(zhì)控菌株與臨床分離株的CA只相差約1%，無統(tǒng)計學(xué)意義。

中國定制藥敏卡也存在一定錯誤率。AST-N334、AST-N335對替加環(huán)素的檢測準(zhǔn)確率均較低，CA分別為81.8%和82.8%，AST-N334 ME占15.2%，MIE占3.0%，AST-N335 MIE占17.2%，主要顯示為假耐藥或假中介，提示在全自動藥敏分析系統(tǒng)革蘭陰性菌替加環(huán)素藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果為耐藥或中介時，應(yīng)采用BMM復(fù)核結(jié)果的準(zhǔn)確性。Vitek 2藥敏專家系統(tǒng)會將部分腸桿菌科細(xì)菌對亞胺培南的敏感結(jié)果修正為耐藥，有學(xué)者[9]對這種情況進(jìn)行了確認(rèn)性試驗(yàn)，結(jié)果顯示Vitek 2藥敏專家系統(tǒng)將敏感結(jié)果修正為耐藥的4株菌株中，1株產(chǎn)CTX-M-15型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶，1株產(chǎn)DHA-1型β-內(nèi)酰胺酶，1株產(chǎn)CTX-M-14合并DHA-1，另外1株陰溝腸桿菌未檢出β-內(nèi)酰胺酶，提示Vitek 2藥敏專家系統(tǒng)修正規(guī)則存在一定誤區(qū)。本研究團(tuán)隊(duì)相關(guān)分析結(jié)果中出現(xiàn)變形桿菌亞胺培南MIC結(jié)果為耐藥而其他碳青霉烯類抗菌藥物為敏感的結(jié)果，經(jīng)BMM證實(shí)亞胺培南結(jié)果為敏感，提示出現(xiàn)該類藥敏譜時，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)采用紙片擴(kuò)散法或BMM驗(yàn)證結(jié)果的準(zhǔn)確性。其他一些誤差尚有待于進(jìn)一步的研究。

AST-N334、AST-N335和AST-P639中國定制藥敏卡使臨床微生物實(shí)驗(yàn)室的藥物敏感性試驗(yàn)實(shí)現(xiàn)了自動化，雖然應(yīng)用起來方便、快捷，但也存在一定局限性。如AST-N334、AST-N335無法報告鮑曼不動桿菌對阿米卡星，普羅威登菌屬對阿莫西林-克拉維酸，支氣管炎博德特菌對頭孢吡肟，黏質(zhì)沙雷菌對亞胺培南、哌拉西林-他唑巴坦的藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果。當(dāng)變形桿菌出現(xiàn)阿莫西林-克拉維酸耐藥、氣單胞菌屬出現(xiàn)亞胺培南或美羅培南耐藥、銅綠假單胞菌出現(xiàn)氨曲南或哌拉西林-他唑巴坦耐藥時，應(yīng)采取替代試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。AST-P639僅用于葡萄球菌屬、腸球菌屬和無乳鏈球菌的藥物敏感性試驗(yàn)，無法報告無乳鏈球菌達(dá)托霉素、紅霉素的藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果，及腐生葡萄球菌頭孢西丁篩選試驗(yàn)的陽性結(jié)果。此外，無乳鏈球菌對氨芐西林和青霉素、金黃色葡萄球菌對頭孢洛林、腸球菌屬和葡萄球菌屬及無乳鏈球菌對利奈唑胺和替加環(huán)素的耐藥性未知。臨床實(shí)驗(yàn)室遇到上述情況應(yīng)予以重視，建議及時采用合適的替代試驗(yàn)以保證藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。