王雨晴 陳志剛 李芳芳 張斯佳 羅玉敏 趙海蘋*

(1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院腦病科, 北京 100029； 2.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院腦血管病研究室， 北京 100053)

神經(jīng)膠質(zhì)細胞是神經(jīng)組織中除神經(jīng)元以外的另一大類細胞，主要有星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞等，可以分泌多種神經(jīng)活性物質(zhì)。胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factors，IGF-1)又名“促生長因子”，在神經(jīng)系統(tǒng)的增生、分化和神經(jīng)功能的調(diào)控方面具有重要作用。研究[1-2]顯示腦組織發(fā)生缺血缺氧損傷后，IGF-1及其受體表達增加，是腦卒中的血管保護因子，可促進神經(jīng)元軸突生長改善神經(jīng)功能[3]。另外，外源性IGF-1能夠改善全腦缺血大鼠及老年小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，可能與其抑制海馬CA1區(qū)細胞凋亡，促進海馬神經(jīng)細胞增生和神經(jīng)元產(chǎn)生，提高磷脂酰肌3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase, PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B, PKB)即PI3K/Akt信號通路中p-Akt、p-mTOR蛋白的表達相關(guān)[4-5]。

MAPK級聯(lián)信號通路在細胞的適應(yīng)、增生、分化、存活、凋亡等方面發(fā)揮重要作用。絲-蘇氨酸激酶PDZ連接激酶(PDZ-binding-kinase，Pbk)是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase kinase，MAPKK)家族的新成員，本課題組前期研究[6]證明在腦缺血后的神經(jīng)元中Pbk的表達被抑制，而缺血后適應(yīng)可以激活Pbk/p-Akt通路從而產(chǎn)生抗細胞氧化損傷和神經(jīng)保護的作用。但是，Pbk在低氧條件下小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞中的變化和作用尚需進一步研究。研究[7-8]顯示IGF-1可能通過MAPK信號通路起到促進細胞增生，發(fā)揮神經(jīng)元的去抑制作用等。同時，基于IGF-1與Akt信號通路的作用[4]，提示IGF-1可能與蛋白激酶Pbk之間存在一定的關(guān)聯(lián)性，但是其上下游關(guān)系尚不清楚。另外，本課題組在前期研究[9]中發(fā)現(xiàn)Pbk可以通過抑制組蛋白去乙?；?(histone deacetylases 2, HDAC2)活性調(diào)控小膠質(zhì)細胞的表型轉(zhuǎn)化。這提示HDAC2與IGF-1之間也可能存在一定的關(guān)聯(lián)性。因此，本實驗通過培養(yǎng)原代星形膠質(zhì)細胞和BV2小膠質(zhì)細胞氧糖剝奪(oxygen and glucose deprivation，OGD)模型探究了缺氧不同時間點后神經(jīng)膠質(zhì)細胞的IGF-1以及Pbk、HDAC2的表達情況，并初步探討了三者之間的關(guān)系，為將來的機制研究提供線索。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與細胞

SPF級C57BL/6孕鼠，孕齡為16～18 d，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，實驗動物許可證號：SCXK(京) 2016-0006, 小鼠小膠質(zhì)BV2細胞系購于北京協(xié)和醫(yī)院基礎(chǔ)所細胞中心。

1.2 主要試劑與儀器

試劑：DMEM/F12培養(yǎng)基購于美國Invitrogen公司，Trizol試劑、無RNA酶的水、無RNA酶的糖原購于美國Invitrogen公司，三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽[tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride, Tris-HCl]、乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA)、3-(N-嗎啉基)丙磺酸[3-(N-morpholino)propanesulfonic acid, MOPS]、溴化乙錠(ethidium bromide，EB)購于華美生物工程公司，乙酸鈉、甲醛、氯仿、異丙醇、100%(體積分?jǐn)?shù))乙醇購于上?；瘜W(xué)試劑有限公司，甲醛上樣染液購于美國Ambion公司，瓊脂糖購于生工生物工程有限公司，RNA酶抑制劑購于美國Epicentre公司，SuperScriptTM III反轉(zhuǎn)錄酶、5×RT緩沖液購于美國Invitrogen公司，2.5 mmol/L dNTP混合液購于芬蘭HyTest公司；2×PCR反應(yīng)混合物購于美國Arraystar公司。

儀器：潔凈工作臺(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)、DK-8D型電熱恒溫水槽(上海森信實驗儀器有限公司)、Gene Amp PCR系統(tǒng)(德國Biosystems公司)、ViiA 7 RT PCR系統(tǒng)(德國Biosystems公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 星形膠質(zhì)細胞的分離

取16～18 d的孕鼠分離胎鼠。放入-20 ℃冰箱內(nèi)低溫麻醉，斷頭前置預(yù)冷的75%(體積分?jǐn)?shù))乙醇中消毒。超凈臺中取出新生大鼠雙側(cè)大腦半球，置于預(yù)冷的解剖液中，在解剖顯微鏡下剪開顱骨及硬腦膜，迅速剝除軟腦膜，并去除嗅球、基底核、海馬，去除腦膜和血管組織。將收集的大腦皮質(zhì)置于預(yù)冷的添加了5%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清的DMEM/F12中，剪碎成組織塊，1 000 r/min離心5 min，棄上清，用0.25%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))胰酶+1 mmol/L EDTA的消化液于37 ℃消化25 min，期間反復(fù)振搖2次，以血清中止消化，反復(fù)吹打使之成為單細胞懸液。離心，棄去上清，D-hank’s 洗滌兩次，過200目的尼龍濾網(wǎng)，收集濾液離心后，棄上清，用完全培養(yǎng)液重懸細胞，接種培養(yǎng)瓶中，37 ℃、5%(體積分?jǐn)?shù))CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，半小時后轉(zhuǎn)入新培養(yǎng)瓶以去除成纖維細胞。3 d后首次換液去除細胞碎片?；旌仙L12～14 d左右，細胞鋪滿瓶底時，旋緊瓶蓋，石蠟?zāi)し饪?，?7 ℃的恒溫搖床中以250 r/min的速度振搖約12～16 h，收集經(jīng)搖床震蕩后的貼壁細胞，以D-Hank’s液沖洗殘留在表面的小膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞，加入新鮮的完全培養(yǎng)液，得到純度較高的星形膠質(zhì)細胞。

1.3.2 小膠質(zhì)細胞的培養(yǎng)

小鼠小膠質(zhì)BV2細胞系購于北京協(xié)和醫(yī)院基礎(chǔ)所細胞中心，于DMEM培養(yǎng)液[10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清+100 U/mL青霉素+100 μg/mL鏈霉素]中，在37 ℃、5%(體積分?jǐn)?shù)) CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察細胞生長情況。待細胞達到70%～80%融合時，輕輕搖動培養(yǎng)瓶，懸浮未貼壁細胞，吸出培養(yǎng)液，加入PBS清洗。吸去PBS加入0.25%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))胰酶，消化1 min 左右，加入完全培養(yǎng)液終止消化。轉(zhuǎn)移到15 mL 無菌離心管中，1 000 r/min離心5 min。棄上清，加入適量培養(yǎng)液將細胞吹打成單細胞懸液，1∶3傳代。

1.3.3 神經(jīng)膠質(zhì)細胞OGD模型與分組

構(gòu)建OGD模型，將細胞換至無糖培養(yǎng)液并置于密閉缺氧盒中，向盒內(nèi)持續(xù)通入95%(體積分?jǐn)?shù))N2+5%(體積分?jǐn)?shù))CO2的混合氣體5 min，使盒內(nèi)的空氣被完全置換成不含氧氣的混合氣體。將缺氧盒置于37 ℃培養(yǎng)箱中，分別于OGD處理后不同時間點收集細胞。星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞各分為4組，分別為對照組、OGD 1 h組、OGD 3 h組和OGD 6 h組，每組6孔。

1.3.4 RT-PCR法檢基因表達水平

采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)法進行檢測。收集不同時間點的神經(jīng)膠質(zhì)細胞用Trizol法進行 RNA提取，使用NanoDrop?ND-1000測定RNA濃度和純度。根據(jù)SuperScriptTM Ⅲ反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行cDNA合成。使用Primer 5.0(英駿生物技術(shù)有限公司)設(shè)計引物，β-actin mRNA作為對照。進行實時定量PCR,引物序列詳見表1。

表1 引物序列

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 OGD后小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞IGF-1的表達情況

細胞缺氧缺糖損傷后，IGF-1在小膠質(zhì)細胞中的表達水平為先升高后下降，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=6.41，P=0.008)，兩兩比較顯示，OGD處理后6 h 下降較為明顯，與其他組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖1A)。IGF-1在星形膠質(zhì)細胞中的表達升高，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=3.701，P=0.029)，兩兩比較顯示，OGD 處理后3 h和6 h明顯高于對照組(P<0.05，圖1B)。

圖1 兩種膠質(zhì)細胞氧糖剝奪后不同時間點IGF-1的表達Fig.1 Expression of IGF-1 at different time points after oxygen and glucose deprivation of the two kinds of glial cellsA: expressions of cytokine IGF-1 in microglia after 1 h, 3 h and 6 h of oxygen and glucose deprivation; B: expressions of cytokine IGF-1 in astrocyte after 1h, 3 h and 6 h of oxygen and glucose deprivation. *P<0.05, **P<0.01 vs control. IGF-1: insulin-like growth factors-1; OGD: oxygen-glucose deprivation. Each group n=6.

2.2 OGD后小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞中Pbk的表達情況

小膠質(zhì)細胞缺氧缺糖1、3和6 h后Pbk的mRNA表達逐漸下降，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=74.1，P<0.001)，兩兩比較顯示，處理后3 h和6 h與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖2A)。星形膠質(zhì)細胞缺氧缺糖1、3和6 h后Pbk的mRNA表達水平逐漸升高，組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F= 14.34，P<0.001)，兩兩比較顯示，OGD處理后3 h和6 h與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖2B)，缺氧缺糖損傷抑制了Pbk在小膠質(zhì)細胞中的表達，增加了Pbk在星形膠質(zhì)細胞中的表達，以O(shè)GD處理后3 h和6 h最為顯著。

圖2 Pbk在兩種膠質(zhì)細胞氧糖剝奪后不同時間點的表達水平Fig.2 Expression levels of Pbk at different time points after oxygen and glucose deprivation of the two kinds of glial cellA: expressions of Pbk in microglia after 1, 3 and 6 h of oxygen and glucose deprivation, ***P<0.001 vs control. B: expressions of Pbk in astrocyte after 1, 3 and 6 h of oxygen and glucose deprivation, ***P<0.001 vs control. Each group n=6. Pbk: PDZ-binding -kinase; OGD: oxygen-glucose deprivation.

圖3 HDAC2在兩種膠質(zhì)細胞氧糖剝奪后不同時間點的表達水平Fig.3 Expression of HDAC2 at different time points after after oxygen and glucose deprivation of the two kinds of glial cellsA: expressions of signal molecule HDAC2 in microglia after after 1, 3 and 6 h of oxygen and glucose deprivation, ***P<0.001 vs control. B: expressions of signal molecule HDAC2 in astrocyte after 1, 3 and 6 h of oxygen and glucose deprivation, **P<0.01, *** P<0.001 vs control. Each group n=6. HDAC2: histone deacetylase 2; OGD: oxygen-glucose deprivation.

2.3 OGD后小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞中HDAC2的表達情況

小膠質(zhì)細胞缺氧缺糖1、3和6 h后HDAC2的mRNA表達逐漸下降，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=27.4，P<0.001)，兩兩比較顯示，OGD處理后6 h 與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖3A)。星形膠質(zhì)細胞缺氧缺糖1、3和6 h后HDAC2的mRNA表達水平逐漸升高，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=8.463，P=0.002)，兩兩比較，OGD處理后3 h和6 h與對照組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖3B)。

2.4 OGD后兩種膠質(zhì)細胞中IGF-1和信號分子Pbk、HDAC2的相關(guān)性

小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞缺氧缺糖損傷后，信號分子Pbk和HDAC2的表達與細胞因子IGF-1的表達均呈正相關(guān)關(guān)系(P<0.05，圖4)。

圖4 小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞中信號分子與細胞因子的相關(guān)性分析Fig.4 Correlation analysis between signaling molecules and cytokines in microglia and astrocyteA: correlation between the signaling molecule Pbk and the cytokine IGF-1 in microglia; B: correlation between signal molecule HDAC2 and cytokine IGF-1 in microglia; C: correlation between the signaling molecule Pbk and HDAC2 in microglia; D: correlation between the signaling molecule Pbk and the cytokine IGF-1 in astrocyte; E:correlation between signal molecule HDAC2 and cytokine IGF-1 in astrocyte; F: correlation between the signaling molecule Pbk and HDAC2 in astrocyte; IGF-1: insulin-like growth factors; Pbk: PDZ-binding-kinase; HDAC2: histone deacetylase 2.

3 討論

本研究結(jié)果顯示在缺糖缺氧的情況下，小膠質(zhì)細胞中IGF-1的mRNA轉(zhuǎn)錄水平降低，星形膠質(zhì)細胞中IGF-1的mRNA轉(zhuǎn)錄水平增加，且均與信號分子Pbk以及HDAC2的變化趨勢相同。盡管在兩種細胞中IGF-1基因表達呈相反趨勢，但是在兩種膠質(zhì)細胞中Pbk、HDAC2均與IGF-1的轉(zhuǎn)錄水平呈顯著正相關(guān)。

研究[10-11]顯示兩種膠質(zhì)細胞兼具神經(jīng)保護或神經(jīng)毒性作用，因此分泌的細胞因子也具有不同的作用。IGF-1在缺氧缺血性腦損傷中可以參與神經(jīng)形成及其髓鞘化，促進血管新生，減少細胞凋亡，起到神經(jīng)保護作用[12-13]。然而其上游調(diào)節(jié)機制目前尚不明晰。

組蛋白去乙?；?histone deacetylases, HDACs)通過調(diào)控組蛋白、非組蛋白的乙?；?，對于基因轉(zhuǎn)錄的穩(wěn)態(tài)維持起到重要作用。HDAC2屬于經(jīng)典的HADACs家族I類成員，在細胞核內(nèi)與共同轉(zhuǎn)錄抑制子結(jié)合，從而使染色體組蛋白、非組蛋白去乙酰化而抑制轉(zhuǎn)錄。研究[14-15]顯示HDAC2可調(diào)節(jié)細胞存活及神經(jīng)元可塑性，有望作為腦卒中后神經(jīng)功能恢復(fù)的治療靶點。HDAC抑制劑(HDAC inhibitor, HDACi)也被證實對腦缺血模型具有一定的神經(jīng)保護作用[16-17]。在骨關(guān)節(jié)炎以及缺氧所致肺動脈高壓等病理基礎(chǔ)研究[18]中顯示，組蛋白的乙?；綄GF-1的表達起到調(diào)控作用。但在腦缺血缺氧性損傷中的研究尚不充分。

本研究結(jié)果提示在膠質(zhì)細胞缺氧缺糖損傷早期，信號分子Pbk、HDAC2以及細胞因子IGF-1在小膠質(zhì)細胞中的表達均下降，在星形膠質(zhì)細胞中的表達均上升。本研究相關(guān)性分析結(jié)果提示，信號分子與細胞因子的表達呈正相關(guān)。

本課題組前期研究[6]顯示Pbk在正常情況下即與HDAC1/2相結(jié)合，腦缺血再灌注損傷后隨著時間的推移其結(jié)合程度增加。在小鼠腦缺血修復(fù)期，Pbk可以通過結(jié)合HDAC1/2增強其磷酸化水平，降低酶的活性，進而增加小膠質(zhì)細胞中組蛋白的乙?；?，促進小膠質(zhì)細胞從神經(jīng)毒性的M1型向神經(jīng)保護的M2型轉(zhuǎn)化，有助于神經(jīng)功能恢復(fù)，是潛在的內(nèi)源性HDAC1/2抑制劑[6]。結(jié)合這一研究基礎(chǔ)，本實驗中OGD處理后小膠質(zhì)細胞Pbk的表達降低，從而導(dǎo)致HDAC2的磷酸化水平降低，HDAC2的活性增強，抑制了組蛋白乙?；?，從而導(dǎo)致IGF-1的分泌減少；相反，OGD處理后星形膠質(zhì)細胞Pbk的表達水平升高，從而導(dǎo)致HDAC2的磷酸化水平升高，HDAC2的活性降低，促進了組蛋白乙酰化水平，從而導(dǎo)致IGF-1的分泌增多。這提示在缺血缺氧早期如能盡早干預(yù)，合理提高Pbk的表達，增加Pbk/HDAC的結(jié)合程度，提高組蛋白乙?；?，有助于促使IGF-1的分泌，促進神經(jīng)血管新生。由此筆者推測，在腦組織缺血缺氧性損傷后，可通過激活Pbk/HDAC2/IGF-1這一信號通路起到神經(jīng)保護作用。

綜上所述，本實驗結(jié)果提示缺氧缺糖損傷顯著促進了星形膠質(zhì)細胞的IGF-1表達，同時抑制了小膠質(zhì)細胞的IGF-1表達，Pbk及HDAC2可能參與到膠質(zhì)細胞分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子的過程，為進一步研究缺血后神經(jīng)保護機制提供了基礎(chǔ)。未來的研究可繼續(xù)探討Pbk以及HDACs參與缺血后神經(jīng)因子分泌的機制以及其他的調(diào)節(jié)通路，為臨床轉(zhuǎn)化提供更多可干預(yù)的分子靶點。