丁 錨 楊 楠 黃語(yǔ)悠 師文娟 閆 峰 趙詠梅 劉克建

(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院 北京市老年病醫(yī)療研究中心 腦血管病轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100053)

缺血性腦卒中是導(dǎo)致長(zhǎng)期神經(jīng)功能障礙的重要原因。腦缺血發(fā)生時(shí)，涉及一系列復(fù)雜的病理生理反應(yīng)，造成內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡，線粒體功能紊亂。線粒體功能障礙可產(chǎn)生大量活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)，進(jìn)而對(duì)神經(jīng)元造成氧化應(yīng)激損傷。本課題組研究[1]顯示，大鼠腦缺血再灌注6 h時(shí)線粒體ROS大量產(chǎn)生，對(duì)缺血神經(jīng)元造成氧化應(yīng)激損傷，進(jìn)而引起細(xì)胞死亡。這一研究結(jié)果首次證明線粒體是腦缺血損傷早期ROS產(chǎn)生的主要來(lái)源，線粒體ROS大量生成是造成腦缺血再灌注早期神經(jīng)元損傷的重要原因之一[1]。多巴胺受體激動(dòng)劑普拉克索(pramipexole，PPX)具有抗氧化活性，為線粒體靶向抗氧化劑。PPX可通過(guò)阻止線粒體通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔的開放，保護(hù)線粒體膜完整性，進(jìn)而抑制線粒體ROS產(chǎn)生[2]。本團(tuán)隊(duì)前期研究[3]表明，R(+)-普拉克索[R(+)-PPX]可顯著減少大鼠腦缺血再灌注6 h時(shí)線粒體ROS的產(chǎn)生，從而降低大鼠腦梗死體積，說(shuō)明R(+)-PPX能對(duì)腦缺血的早期損傷產(chǎn)生保護(hù)作用。但腦缺血再灌注早期R(+)-PPX的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制尚不明確。

內(nèi)源性酪氨酸激酶2(janus kinase 2，JAK2)-信號(hào)轉(zhuǎn)換器和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)信號(hào)通路是多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子在細(xì)胞內(nèi)傳遞信號(hào)的共同途徑，與機(jī)體各種生命活動(dòng)密切相關(guān)。JAK2-STAT3通路的激活參與了細(xì)胞增殖、炎性反應(yīng)、血管生成和細(xì)胞凋亡等多種生理病理活動(dòng)[4]。目前關(guān)于JAK2-STAT3通路是否在腦缺血再灌注早期發(fā)展階段就被激活的研究尚少。磷酸化STAT3(phosphorylated STAT3，p-STAT3)是STAT3的激活形式，有研究[5]表明，H2O2處理的大鼠成纖維細(xì)胞中STAT3被顯著激活，并且過(guò)表達(dá)的p-STAT3可被抗氧化劑抑制，表明JAK2-STAT3信號(hào)通路可能在調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。STAT3除了分布在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核以外，也存在于線粒體中，ROS對(duì)心肌細(xì)胞線粒體STAT3的氧化作用，使得STAT3被激活[6]。然而，目前暫無(wú)研究明確報(bào)道，在腦缺血再灌注早期，線粒體ROS是否通過(guò)激活JAK2-STAT3通路產(chǎn)生神經(jīng)損傷作用。

炎性反應(yīng)是腦缺血再灌注損傷的重要病理生理機(jī)制之一，腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)在腦缺血損傷后表達(dá)上調(diào)，通過(guò)促進(jìn)炎性反應(yīng)加快細(xì)胞凋亡。有文獻(xiàn)[7]報(bào)道，誘導(dǎo)線粒體ROS產(chǎn)生可增加炎性因子的釋放，提示線粒體ROS可直接調(diào)節(jié)炎性因子的表達(dá)。另外，JAK2-STAT3也是一條重要的炎性反應(yīng)相關(guān)通路，JAK2-STAT3通路的激活參與炎性反應(yīng)相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程。研究[8]顯示，應(yīng)用JAK2抑制劑AG490可抑制STAT3活化，進(jìn)而明顯下調(diào)成纖維細(xì)胞內(nèi)TNF-α的表達(dá)水平，說(shuō)明JAK2-STAT3通路的激活也能影響TNF-α的表達(dá)。

為了深入探究R(+)-PPX保護(hù)腦缺血再灌注早期損傷的機(jī)制，本研究采用大腦中動(dòng)脈梗塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)再灌注模型大鼠，觀察缺血再灌注6 h時(shí)缺血腦組織p-JAK2、p-STAT3和TNF-α的表達(dá)變化，以及R(+)-PPX對(duì)缺血大鼠腦內(nèi)JAK2-STAT3通路和TNF-α表達(dá)的影響，以期為R(+)-PPX的腦保護(hù)作用研究提供更多的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

健康雄性SD大鼠體質(zhì)量為280～320 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)2012-0001，于SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室恒溫飼養(yǎng)，術(shù)前12 h禁食水。將30只大鼠應(yīng)用數(shù)字表法隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組(Sham組)、MCAO再灌注6 h組(MCAO組)和MCAO再灌注6 h+R(+)-PPX組[R(+)-PPX組]。每組10只大鼠。R(+)-PPX溶于0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液(以下簡(jiǎn)稱生理鹽水)中。R(+)-PPX組于MCAO前30 min腹腔一次性注射R(+)-PPX，劑量為1 mg/kg[1]，Sham組和MCAO組皮下注射同等體積的生理鹽水。

1.2 主要儀器設(shè)備

小動(dòng)物麻醉機(jī)(Harvard Apparatus公司，美國(guó))、手術(shù)顯微鏡(Carl Zeiss公司，德國(guó))、反饋式溫度調(diào)節(jié)儀(CMA 150,Carnegie Medicin公司，瑞典)、雙極電凝器(ACC100,北京德威醫(yī)療器械有限公司)、小動(dòng)物呼吸機(jī)(Harvard Apparatus 683，Harvard Apparatus公司，美國(guó))、冰凍切片機(jī)(Thermo Fisher Scientific公司，美國(guó))、熒光顯微鏡(Nikon公司，日本)。

1.3 試劑

恩氟烷(河北一品制藥有限公司)；水合氯醛(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院)； R(+)-PPX(Sigma公司，美國(guó))；DHE(Sigma公司，美國(guó))；p-JAK2抗體(CST公司，美國(guó)); p-STAT3抗體(CST公司，美國(guó))；TNF-α抗體(CST公司，美國(guó))；β-actin抗體(Santa Cruz公司，美國(guó))等。

1.4 動(dòng)物模型制作

MCAO大鼠模型的制備依照改良Zea Longa法。在70%(體積分?jǐn)?shù))N2O和30%(體積分?jǐn)?shù))O2中混合5%(體積分?jǐn)?shù))恩氟烷誘導(dǎo)麻醉，而后改用面罩吸入2%(體積分?jǐn)?shù))恩氟烷維持麻醉。大鼠仰臥位固定，去除頸部毛并消毒后，沿頸部正中線做一縱行切口，分離且?jiàn)A閉右側(cè)頸總動(dòng)脈。分離右側(cè)頸外動(dòng)脈，結(jié)扎并電凝斷后，眼科剪呈 45°在右側(cè)頸外動(dòng)脈近心端血管壁上剪一小口，將尼龍線栓(頭端直徑為0.38 mm)插入至大腦中動(dòng)脈起始端處固定線栓。術(shù)中使用反饋性控溫毯監(jiān)測(cè)術(shù)中大鼠肛溫，使其維持在(37.0±0.5)℃，并檢測(cè)大鼠心率及血壓。于缺血90 min 后拔出線栓，進(jìn)行再灌注。Sham組大鼠相應(yīng)部位皮膚切開分離血管后不插栓即縫合。

1.5 DHE染色

Sham組、MCAO組以及R(+)-PPX組大鼠腹腔注射水合氯醛，快速斷頭取腦包埋，行腦組織冰凍切片，每片腦組織厚度均為20 μm。未進(jìn)行固定的新鮮冰凍切片浸入10 μmol/L的超氧化物陰離子熒光探針(dihydroethidium，DHE)溶液中(生理鹽水溶解)，避光條件下37 ℃孵育90 min后用PBS沖洗，封片后于熒光顯微鏡下觀察，觀察區(qū)域?yàn)槿毖獋?cè)腦皮質(zhì)中的半暗帶區(qū)。

1.6 免疫熒光雙標(biāo)染色

各組大鼠腦組織冰凍切片(厚度20 μm)于預(yù)冷的4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚甲醛中固定10 min，PBS漂洗后用含0.2%(體積分?jǐn)?shù))TritonX-100的PBS室溫孵育10 min，之后滴加5%(體積分?jǐn)?shù))山羊血清室溫封閉30 min，棄血清，滴加一抗(p-STAT3抗體 1∶100，TNF-α抗體 1∶100)，4 ℃孵育過(guò)夜。次日將切片于室溫復(fù)溫1 h，PBS漂洗3次，滴加熒光二抗(1∶200稀釋)，室溫避光孵育1 h。PBS漂洗3次，滴加含DAPI(4′,6-diamidino-2-phenylindole)的封片劑，之后在熒光顯微鏡下觀察。

ROS分別與p-STAT3、TNF-α的熒光雙標(biāo)染色：腦組織冰凍切片用DHE熒光染劑孵育90 min。PBS沖洗后，滴加一抗(p-STAT3抗體1∶100，TNF-α抗體 1∶100)孵育過(guò)夜。次日將切片室溫復(fù)溫1 h，PBS漂洗后，滴加熒光二抗(1∶200稀釋)。用含DAPI的封片劑封片后在熒光顯微鏡下觀察。

1.7 Western blotting檢測(cè)

取新鮮大鼠右側(cè)腦組織，立即于前囟0～-0.1處切取1 mm厚的腦組織冠狀切片。加入含有蛋白酶抑制劑的裂解液后，將缺血側(cè)腦組織于冰上勻漿，冰浴靜置30 min后，4 ℃條件下12 000 g離心30 min取上清。用BCA法測(cè)定蛋白濃度。樣品中加入上樣緩沖液煮沸，采用SDS-PAGE電泳濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜90 min，于5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))脫脂牛奶室溫下封閉1 h，加入一抗(p-JAK-2抗體1∶1 000，β-actin抗體1∶1 000)孵育過(guò)夜，次日用TBST洗膜3次，室溫下于HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠/兔(1∶6 000)二抗中孵育1 h，TBST洗膜3次，用ECL化學(xué)發(fā)光液顯色，并用化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)掃描檢測(cè)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 R(+)-PPX抑制MCAO大鼠缺血側(cè)腦組織p-JAK2的表達(dá)

Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，3組間大鼠右側(cè)腦組織p-JAK2表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩兩比較結(jié)果顯示，與Sham組相比，MCAO組大鼠再灌注6 h缺血側(cè)腦組織p-JAK2表達(dá)量明顯增加；與MCAO組大鼠相比，R(+)-PPX組大鼠再灌注6 h缺血側(cè)腦組織p-JAK2表達(dá)量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖1)。

圖1 蛋白免疫印跡法檢測(cè)Sham、MCAO及R(+)-PPX組大鼠再灌注6 h缺血腦組織p-JAK2蛋白的表達(dá)Fig.1 Expression of p-JAK2 in ischemic brain tissue of Sham, MCAO and R(+)-PPX groups after 6 h reperfusion Representative Western blotting images of p-JAK2 and quantification of optical density measurements normalized to β-actin. Data are (n=6). *P<0.05 vs Sham group, #P<0.05 vs MCAO group; MCAO: middle cerebral artery occlusion; PPX: pramipexole; p-JAK2: phosphor-ylated-janus kinase 2.

2.2 R(+)-PPX抑制MCAO大鼠腦缺血半暗帶區(qū)p-STAT3的表達(dá)

免疫熒光染色結(jié)果顯示，Sham組大鼠與缺血半暗帶相對(duì)應(yīng)的腦區(qū)未見(jiàn)p-STAT3綠色熒光陽(yáng)性細(xì)胞，而MCAO、R(+)-PPX組大鼠再灌注6 h缺血半暗帶區(qū)均可見(jiàn)p-STAT3陽(yáng)性細(xì)胞(圖2A)，3組間大鼠缺血半暗帶區(qū)p-STAT3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩兩比較結(jié)果顯示，與Sham組相比，MCAO組大鼠再灌注6 h缺血半暗帶區(qū)p-STAT3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增加；與MCAO組相比，R(+)-PPX組大鼠再灌注6 h缺血半暗帶區(qū)p-STAT3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖2B)。

2.3 腦缺血再灌注早期，大鼠腦缺血半暗帶區(qū)ROS與p-STAT3共定位

熒光雙標(biāo)結(jié)果顯示，MCAO組大鼠再灌注6 h缺血半暗帶區(qū)ROS熒光探針DHE呈現(xiàn)紅色熒光，p-STAT3免疫熒光染色陽(yáng)性細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光，DAPI染色細(xì)胞核為藍(lán)色熒光。進(jìn)行圖像合并后發(fā)現(xiàn)，DHE的紅色熒光陽(yáng)性細(xì)胞和p-STAT3的綠色熒光陽(yáng)性細(xì)胞重合，說(shuō)明ROS與p-STAT3共定位(圖2A)。提示腦缺血再灌注早期，ROS的產(chǎn)生與STAT3的激活相關(guān)。

圖2 熒光雙標(biāo)染色法檢測(cè)Sham、MCAO與R(+)-PPX組大鼠再灌注6 h腦缺血半暗帶區(qū)p-STAT3和ROS的表達(dá)Fig.2 Expression of p-STAT3 and ROS in the ischemic penumbra of Sham, MCAO and R(+)-PPX groups after 6 h reperfusionA： representative double labeling fluorescence images for the colocalization of ROS (red) and p-STAT3 (green) after 6 h reperfusion. Scale bar=20 μm; B: quantification of p-STAT3 positive cells. Data are (n=6). *P<0.05 vs Sham group, #P<0.05 vs MCAO group; MCAO: middle cerebral artery occlusion; PPX: pramipexole; p-STAT3: phosphorylated signal transducer and activator of transcription 3; ROS: reactive oxygen species; DAPI: 4′,6-diamidino-2-phenylindole.

2.4 腦缺血再灌注早期，大鼠腦缺血半暗帶區(qū)ROS與炎性因子TNF-α共定位，且R(+)-PPX減少M(fèi)CAO大鼠腦缺血半暗帶區(qū)TNF-α的表達(dá)

熒光染色結(jié)果顯示，MCAO組大鼠再灌注6 h缺血半暗帶區(qū)ROS熒光探針DHE呈現(xiàn)紅色熒光，TNF-α免疫熒光染色陽(yáng)性細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光，DAPI染色細(xì)胞核為藍(lán)色熒光。進(jìn)行圖像合并后發(fā)現(xiàn)，DHE的紅色熒光陽(yáng)性細(xì)胞和TNF-α的綠色熒光陽(yáng)性細(xì)胞重合，說(shuō)明ROS與TNF-α共定位(圖3A)。

Sham組大鼠與缺血半暗帶相對(duì)應(yīng)的腦區(qū)未見(jiàn)TNF-α綠色熒光陽(yáng)性細(xì)胞，而MCAO、R(+)-PPX組大鼠再灌注6 h缺血半暗帶區(qū)均可見(jiàn)TNF-α陽(yáng)性細(xì)胞(圖3A)，3組間大鼠缺血半暗帶區(qū)TNF-α陽(yáng)性細(xì)胞差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩兩比較結(jié)果顯示，與Sham組相比，MCAO組大鼠再灌注6 h缺血半暗帶區(qū)TNF-α陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增加；與MCAO組大鼠相比，R(+)-PPX組大鼠再灌注6 h缺血半暗帶區(qū)TNF-α陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖3B)。

2.5 腦缺血再灌注早期，大鼠腦缺血半暗帶區(qū)p-STAT3與TNF-α共定位

免疫熒光雙標(biāo)染色結(jié)果顯示，MCAO組大鼠再灌注6 h缺血半暗帶區(qū)p-STAT3呈現(xiàn)紅色熒光，TNF-α免疫熒光染色陽(yáng)性細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光，DAPI染色細(xì)胞核為藍(lán)色熒光。進(jìn)行圖像合并后發(fā)現(xiàn)，p-STAT3陽(yáng)性細(xì)胞的紅色熒光和TNF-α陽(yáng)性細(xì)胞的綠色熒光重合，說(shuō)明腦缺血再灌注早期，大鼠腦缺血半暗帶區(qū)p-STAT3與TNF-α共定位(圖3C)。

圖3 熒光雙標(biāo)染色法檢測(cè)Sham、MCAO與R(+)-PPX組大鼠再灌注6 h腦缺血半暗帶區(qū)TNF-α和ROS的表達(dá)；免疫熒光雙標(biāo)染色法檢測(cè)MCAO大鼠腦缺血半暗帶區(qū)p-STAT3和TNF-α的表達(dá)Fig.3 Expression of TNF-α and ROS in the ischemic penumbra of Sham, MCAO and R(+)-PPX groups after 6 h reperfusion；expression of p-STAT3 and TNF-α in the ischemic penumbra of MCAO ratsA： representative double labeling fluorescence images for the colocalization of ROS (red) and TNF-α (green) after 6 h reperfusion. Scale bar=20 μm; B: quantification of TNF-α positive cells. Data are (n=6). *P<0.05 vs Sham group, #P<0.05 vs MCAO group; C: representative double labeling immunofluorescence images of p-STAT3 (red) and TNF-α (green) after 6 h reperfusion. Scale bar=20 μm; MCAO: middle cerebral artery occlusion; PPX: pramipexole; TNF-α: tumor necrosis factor-α; ROS: reactive oxygen species; p-STAT3: phosphorylated STAT3; DAPI: 4′,6-diamidino-2-phenylindole.

3 討論

氧化應(yīng)激是腦缺血再灌注過(guò)程中加重腦組織損傷的重要原因之一。在腦缺血后，特別是再灌注發(fā)生時(shí)，神經(jīng)元內(nèi)產(chǎn)生大量自由基、過(guò)氧化物等造成細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷[9]。線粒體是體內(nèi)超氧化物的主要來(lái)源之一，本課題組最近的研究[1]顯示，腦缺血再灌注早期的氧化應(yīng)激損傷主要是由于線粒體ROS大量產(chǎn)生造成的，因此抑制線粒體ROS可能對(duì)早期腦缺血再灌注損傷具有神經(jīng)保護(hù)作用。PPX是線粒體靶向抗氧化劑，能抑制線粒體ROS的產(chǎn)生。筆者在實(shí)驗(yàn)中證明，R(+)-PPX可明顯減少腦缺血再灌注6 h大鼠缺血大腦半球線粒體ROS的生成，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[3]。然而，R(+)-PPX在缺血性腦損傷過(guò)程中發(fā)揮早期腦保護(hù)作用的具體機(jī)制尚不完全清楚。

JAK2-STAT3作為重要的細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，參與細(xì)胞增殖分化、氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)等多個(gè)生理病理環(huán)節(jié)。有研究[10]顯示，JAK2-STAT3通路在腦缺血再灌注24 h后被激活，說(shuō)明JAK2-STAT3通路參與腦缺血損傷。但目前關(guān)于JAK2、STAT3是否在腦缺血再灌注早期即被激活的研究尚少。筆者利用Western blotting檢測(cè)腦缺血大鼠再灌注6 h后缺血側(cè)腦組織中p-JAK2表達(dá)量，免疫熒光染色法檢測(cè)p-STAT3的水平，研究結(jié)果顯示,MCAO組大鼠再灌注6 h,缺血半暗帶區(qū)p-JAK2及p-STAT3表達(dá)量比Sham組明顯增加，說(shuō)明 JAK2-STAT3通路在腦缺血再灌注早期即被激活。

研究[5，11]證明，JAK2-STAT3信號(hào)通路在氧化應(yīng)激損傷的細(xì)胞及動(dòng)物模型中被激活，提示該信號(hào)通路可能在調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。有文獻(xiàn)[12]報(bào)道，ROS作為一種信號(hào)分子可激活JAK2，進(jìn)而導(dǎo)致STAT3磷酸化。而清除活性氧能抑制體內(nèi)STAT3磷酸化。由此可見(jiàn)，ROS對(duì)于啟動(dòng)JAK2-STAT3通路具有重要意義。為了探究ROS在腦缺血再灌注早期能否介導(dǎo)JAK2-STAT3通路的激活。筆者對(duì)MCAO再灌注6 h大鼠缺血半暗帶區(qū)ROS與p-STAT3進(jìn)行熒光雙標(biāo)染色，結(jié)果顯示ROS與p-STAT3共定位，說(shuō)明腦缺血再灌注6 h時(shí)，STAT3的激活與ROS的產(chǎn)生密切相關(guān)。筆者還發(fā)現(xiàn)，腹腔注射R(+)-PPX抑制ROS后，大鼠缺血腦組織內(nèi)p-JAK2、p-STAT3表達(dá)水平均顯著下降。該結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明，腦缺血再灌注早期，線粒體ROS的大量產(chǎn)生可激活JAK2-STAT3通路。結(jié)合本課題組之前的研究[3]結(jié)果，給予R(+)-PPX治療能明顯降低MCAO再灌注6 h大鼠腦梗死體積，減少細(xì)胞凋亡，筆者推測(cè)，R(+)-PPX很可能通過(guò)抑制JAK2-STAT3通路的激活，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

炎性反應(yīng)是加重腦缺血再灌注損傷的重要原因之一，腦缺血急性期大量釋放的TNF-α是缺血后炎性損傷的重要啟動(dòng)因子[13]。有研究[14]顯示，線粒體ROS參與銅誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞炎性反應(yīng)的過(guò)程，抑制ROS可緩解銅導(dǎo)致的炎性反應(yīng)，降低炎性因子TNF-α的水平。為了觀察腦缺血再灌注損傷后TNF-α的表達(dá)是否與ROS有關(guān)，本研究對(duì)TNF-α和ROS進(jìn)行熒光染色雙標(biāo)，結(jié)果顯示,大鼠缺血半暗帶區(qū)TNF-α陽(yáng)性細(xì)胞與ROS共定位，說(shuō)明腦缺血再灌注早期TNF-α的表達(dá)與ROS密切相關(guān)。給予R(+)-PPX抑制線粒體ROS產(chǎn)生后可明顯降低MCAO再灌注6 h大鼠腦缺血半暗帶區(qū)TNF-α的表達(dá)量，進(jìn)一步說(shuō)明，腦缺血再灌注早期線粒體ROS能直接誘導(dǎo)炎性因子TNF-α的表達(dá)。另外，研究[10]報(bào)道，JAK2-STAT3通路被激活后，p-STAT3與細(xì)胞核DNA結(jié)合從而增加炎性因子的表達(dá)。對(duì)周圍巨噬細(xì)胞的研究[15]也發(fā)現(xiàn)，JAK2-STAT3的激活能介導(dǎo)炎性因子的釋放，誘發(fā)巨噬細(xì)胞炎性反應(yīng)。本研究用免疫熒光染色法對(duì)p-STAT3和TNF-α進(jìn)行雙標(biāo)，發(fā)現(xiàn)p-STAT3陽(yáng)性細(xì)胞和TNF-α陽(yáng)性細(xì)胞在大鼠腦缺血半暗帶區(qū)能夠重合，說(shuō)明腦缺血再灌注損傷后TNF-α的產(chǎn)生與p-STAT3的激活有關(guān)。因此，筆者推測(cè)，腦缺血再灌注損傷后線粒體ROS也可能是通過(guò)激活JAK2-STAT3通路，進(jìn)而引起炎性因子TNF-α的表達(dá)增加。

了解線粒體ROS損傷神經(jīng)元的機(jī)制，對(duì)于早期挽救缺血半暗帶具有重要意義。本研究重點(diǎn)探究了腦缺血再灌注損傷早期，R(+)-PPX發(fā)揮抗氧化作用的機(jī)制。證明R(+)-PPX通過(guò)減少M(fèi)CAO再灌注6 h大鼠線粒體ROS產(chǎn)生，抑制JAK2-STAT3通路激活，降低TNF-α表達(dá)，產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用。該結(jié)果在本課題組前期研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步完善了線粒體ROS造成腦缺血再灌注早期損傷的機(jī)制，并為深入探討R(+)-PPX的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制提供了相關(guān)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。