房亞蘭 楊 楠 趙詠梅* 黃語悠 李錦程 段云霞 高 利 羅玉敏

(1. 北京市平谷區(qū)醫(yī)院全科醫(yī)療科，北京 101200； 2. 首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院 北京市老年病醫(yī)療研究中心，北京 100053)

缺血性腦血管病目前仍是全球范圍內(nèi)的主要死因與長期殘疾的主要原因[1]。通過組織纖溶酶原激活劑tPA介導(dǎo)的溶栓和血管內(nèi)血栓切除術(shù)是臨床治療急性缺血性腦血管病的主要有效手段，但卻受到狹窄的治療時間窗的限制，并且缺血后恢復(fù)血液供應(yīng)也可造成再灌注損傷。因此，探索治療缺血性腦血管病的有效藥物具有重大意義。本課題組近年來的研究[2-3]表明，從大黃中提取的主要活性成分之一大黃酚(chrysophanol, CHR)對腦缺血再灌注損傷有神經(jīng)保護作用，能提高腦缺血小鼠的生存率，減小腦梗死體積，并改善其神經(jīng)功能評分，且CHR的腦保護作用可持續(xù)至再灌注后第14天，說明CHR在防治缺血性腦血管病方面具有潛在的臨床應(yīng)用前景。但CHR對腦缺血再灌注損傷的長期保護作用機制目前尚不完全清楚。

缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α)是HIF-1的誘導(dǎo)型調(diào)節(jié)亞單位。正常情況下，由于泛素蛋白酶體系統(tǒng)的快速降解，HIF-1α極不穩(wěn)定，HIF-1α蛋白水平非常低甚至很難被檢測出來[4]。當(dāng)組織缺血缺氧時，HIF-1α表達水平升高。HIF-1α在神經(jīng)損傷中有雙刃劍的作用[5]。文獻[6]報道，顱腦損傷預(yù)后不良患者的血清中HIF-1α水平明顯高于預(yù)后良好組，HIF-1α的水平變化可作為腦損傷預(yù)后的預(yù)測指標(biāo)之一。還有研究[7]顯示，新生大鼠腦缺氧缺血可誘導(dǎo)HIF-1α表達，HIF-1α表達的上調(diào)可導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡。筆者之前的研究[8]表明，在MCAO大鼠缺血側(cè)的腦組織中HIF-1α表達顯著增加，促進腦缺血再灌注損傷。說明HIF-1α表達上調(diào)可能是造成缺血性腦損傷中神經(jīng)元死亡的重要原因之一。研究[9]顯示，大黃可通過抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠TNF-α-HIF-1α-iNOS-NO信號通路，減輕炎癥反應(yīng)，從而延緩類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的進展。然而，HIF-1α是否參與CHR的腦保護作用，目前尚無研究報道。

血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)是一種能夠促進內(nèi)皮細胞分裂的特異性有絲分裂原，其與內(nèi)皮細胞上的受體結(jié)合可調(diào)節(jié)血管通透性、誘導(dǎo)血管的生成與神經(jīng)修復(fù)[10]。VEGF還可直接作用于神經(jīng)細胞，參與神經(jīng)元形成及神經(jīng)功能調(diào)節(jié)，保護缺血性神經(jīng)元免受損傷并促進大腦可塑性，發(fā)揮神經(jīng)保護和神經(jīng)營養(yǎng)作用[11-12]。予以大腦中動脈梗塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)大鼠側(cè)腦室注射miR-377抑制劑或腹腔注射依達拉奉，可顯著上調(diào)缺血半暗帶區(qū)VEGF表達，保護半暗帶區(qū)毛細血管內(nèi)皮細胞，促進血管生成，從而減輕缺血性腦損傷[13-14]。此外，電針刺激肝俞穴和腎俞穴可促進MCAO大鼠缺血半暗帶區(qū)VEGF和血小板-內(nèi)皮細胞黏附分子蛋白表達，改善神經(jīng)功能缺損[15]。VEGF還可以減少神經(jīng)元凋亡，提高細胞存活率，減少腦梗死體積，從而減輕腦缺血損傷[16]。

為了探究CHR長期拮抗腦缺血再灌注損傷的作用機制，本項研究應(yīng)用小鼠制作MCAO再灌注模型，觀察CHR對實驗小鼠腦缺血再灌注后14 d缺血半暗帶區(qū)HIF-1α及VEGF表達水平的影響，從而進一步探討CHR對腦損傷的保護機制。

1 材料與方法

1.1 主要儀器設(shè)備

麻醉機(Harvard Apparatus公司，美國)、手術(shù)顯微鏡(Carl Zeiss公司，德國)、雙極電凝器(ACC100,北京德威醫(yī)療器械有限公司)、反饋式溫度調(diào)節(jié)儀(CMA 150, Carnegie Medicin公司，瑞典)、冰凍切片機(Thermo Fisher Scientific公司，美國)、熒光顯微鏡(Nikon公司，日本)。

1.2 試劑

恩氟烷(河北一品制藥有限公司)；CHR(中國食品藥品檢定研究院)；Tween 80(Sigma公司，美國)；HIF-1α抗體(Novus公司，美國)；VEGF抗體(Santa Cruz公司，美國)；NeuN抗體(Millipore公司，美國)等。

1.3 實驗動物及分組

18只健康雄性2月齡C57BL小鼠，體質(zhì)量(23.5±1) g，實驗動物許可證號：SCXK(京) 2012-0001(北京維通利華實驗動物公司)，飼養(yǎng)于SPF級動物實驗室。采用數(shù)字表法隨機將小鼠分為3組：假手術(shù)(Sham)組、MCAO組、CHR組。CHR溶于含1%(體積分?jǐn)?shù))Tween 80和1%(體積分?jǐn)?shù))DMSO的0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液(以下簡稱生理鹽水)中，自造模當(dāng)天開始，CHR組小鼠按0.1 mg/kg[2]腹腔注射CHR，Sham組和MCAO組小鼠腹腔注射同等體積的含1%(體積分?jǐn)?shù))Tween 80和1%(體積分?jǐn)?shù))DMSO的生理鹽水，每日1次，直至再灌注后14 d。

1.4 動物模型制作

按照改良的ZeaLonga法[8]制備MCAO模型。首先將恩氟烷混合于70%(體積分?jǐn)?shù))N2O和30%(體積分?jǐn)?shù))O2中，用5%(體積分?jǐn)?shù))恩氟烷進行誘導(dǎo)麻醉，再用2%(體積分?jǐn)?shù))恩氟烷予以維持麻醉。于小鼠頸部的正中線做一縱行切口，分離右側(cè)的頸總動脈、頸內(nèi)動脈及頸外動脈，將頭端直徑為0.38 mm的尼龍線栓自頸外動脈殘端插入頸內(nèi)動脈，直至頸外動脈和頸內(nèi)動脈分叉約1 cm處。手術(shù)過程中使用反饋式溫度調(diào)節(jié)儀監(jiān)測實驗小鼠肛溫，維持肛溫在(37.0±0.5) ℃范圍。經(jīng)缺血45 min后，小心地將線栓拔出進行缺血后再灌注。術(shù)后小鼠仍飼養(yǎng)于SPF級動物實驗室，自由進食飲水。

1.5 免疫熒光雙標(biāo)染色

于再灌注后14 d，各組小鼠經(jīng)腹腔注射水合氯醛麻醉后，快速斷頭取腦，先后于4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚甲醛后固定48 h、30%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))蔗糖脫水24 h，將腦組織按照每片20 μm的厚度進行連續(xù)冰凍切片，切片經(jīng)PBS洗后，用含0.2%(體積分?jǐn)?shù))TritonX-100的PBS孵育10 min，再經(jīng)PBS洗后，于室溫下用5%(體積分?jǐn)?shù))山羊血清封閉30 min，滴加一抗(HIF-1α與NeuN抗體1∶300稀釋或VEGF與NeuN抗體1∶300稀釋)，4 ℃孵育過夜。次日取出切片，經(jīng)PBS洗后，滴加熒光二抗(1∶300)，避光于室溫下孵育1 h。經(jīng)PBS洗后，最后用含DAPI(4′,6-diamidino-2-phenylindole)的封片劑進行封片。于熒光顯微鏡下觀察小鼠腦皮質(zhì)的缺血半暗帶區(qū)。在相同的放大倍數(shù)及參數(shù)下，每張腦組織冰凍切片隨機選取4個視野照相，使用NIS Element軟件統(tǒng)計HIF-1α和VEGF的陽性細胞數(shù)目。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 CHR抑制MCAO小鼠腦缺血半暗帶區(qū)HIF-1α表達

免疫熒光標(biāo)記結(jié)果可見，Sham組小鼠腦組織內(nèi)偶見HIF-1α紅色熒光染色，MCAO組小鼠腦缺血半暗帶區(qū)內(nèi)有大量的HIF-1α紅色熒光染色陽性細胞，CHR組小鼠腦缺血半暗帶區(qū)HIF-1α陽性細胞數(shù)目比MCAO組明顯減少(圖1A)，3組間HIF-1α陽性細胞數(shù)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。兩兩比較結(jié)果顯示，MCAO組HIF-1α陰性細胞數(shù)量較Sham組明顯增多，CHR組較MCAO組明顯減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖1B)。

圖1 免疫熒光雙標(biāo)染色法檢測腦缺血再灌注后14 d Sham、MCAO與CHR組小鼠腦缺血半暗帶區(qū)HIF-1α與NeuN的表達Fig.1 Double labeling immunofluorescent images of HIF-1α and NeuN in cerebral ischemia penumbra of Sham, MCAO and CHR groups 14 d after reperfusion A: Representative double immunofluorescence labeling images of HIF-1α (red)/NeuN (green) on 14 d after ischemia/reperfusion. Scale bar=20 μm. B: Quantification of HIF-1α-positive cells. (n=5, mean±SD) *P<0.05 vs Sham group, #P<0.05 vs MCAO group; MCAO: middle cerebral artery occlusion; CHR: chrysophanol; HIF-1α: hypoxia inducible factor-α; DAPI: 4′,6-diamidino-2-phenylindole.

2.2 CHR促進MCAO小鼠腦缺血半暗帶區(qū)VEGF表達

免疫熒光標(biāo)記結(jié)果顯示，Sham組小鼠腦組織內(nèi)可見大量的VEGF紅色熒光染色陽性細胞，MCAO組小鼠腦缺血半暗帶區(qū)VEGF陽性細胞數(shù)量明顯減少，CHR組小鼠腦缺血半暗帶區(qū)VEGF陽性細胞數(shù)目比MCAO組明顯增加(圖2A)，3組間VEGF陽性細胞數(shù)量比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。兩兩比較結(jié)果顯示，MCAO組VEGF陽性細胞數(shù)量較Sham組明顯減少，CHR組較MCAO組明顯增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖2B)。

圖2 免疫熒光雙標(biāo)染色法檢測腦缺血再灌注后14 d Sham、MCAO與CHR組小鼠腦缺血半暗帶區(qū)VEGF與NeuN的表達Fig.2 Double labeling immunofluorescent images of VEGF and NeuN in cerebral ischemia penumbra of Sham,MCAO and CHR groups 14 d after reperfusion A: Representative double labeling immunofluorescent of VEGF (red)/NeuN (green) on 14 d after ischemia/reperfusion. Scale bar=20 μm. B: Quantification of VEGF-positive cells. (n = 5, mean±SD) *P<0.05 vs Sham group, #P<0.05 vs MCAO group; MCAO: middle cerebral artery occlusion; CHR: chrysophanol; VEGF: vascular endothelial growth factor; DAPI: 4′,6-diamidino-2-phenylindole.

2.3 小鼠腦缺血半暗帶區(qū)HIF-1α、VEGF分別與NeuN共定位

在MCAO小鼠腦缺血半暗帶區(qū)內(nèi)可見HIF-1α陽性細胞及NeuN陽性細胞，其中HIF-1α陽性細胞為紅色熒光，NeuN陽性細胞為綠色熒光，細胞核為藍色熒光(圖1A)。圖像合并后，紅色與綠色熒光能夠重合，表明HIF-1α與神經(jīng)元共定位，即腦缺血再灌注后在缺血半暗帶區(qū)神經(jīng)元內(nèi)有HIF-1α表達。

在CHR組小鼠腦缺血半暗帶區(qū)內(nèi)可見VEGF陽性細胞及NeuN陽性細胞，其中VEGF陽性細胞為紅色熒光，NeuN陽性細胞為綠色熒光，細胞核為藍色熒光(圖2A)，圖像合并后，紅色與綠色熒光重合，表明VEGF與神經(jīng)元共定位，即CHR促進腦缺血小鼠腦神經(jīng)元內(nèi)VEGF的表達。

3 討論

缺血性卒中是一種常見的腦血管疾病，發(fā)病率高，是世界范圍內(nèi)嚴(yán)重致殘和致死的主要原因之一[17]，目前臨床上對腦缺血再灌注損傷的治療存在各種局限性，用于治療腦缺血的藥物仍不足以顯著改善患者預(yù)后。因此，有必要為腦缺血再灌注損傷尋找有效的治療方法。有研究者[18]發(fā)現(xiàn)，術(shù)前30 min給予大黃酚能改善再灌注24 h大鼠的神經(jīng)功能評分，減少腦梗死體積。但是CHR在腦缺血再灌注損傷中發(fā)揮長期神經(jīng)保護作用的研究尚少。本課題組前期的研究[3]表明，腦缺血再灌注后14 d，CHR能保護MCAO小鼠的腦缺血損傷，改善腦缺血再灌注小鼠的預(yù)后，提示CHR對腦缺血再灌注損傷具有長期的神經(jīng)保護作用。本團隊前期還發(fā)現(xiàn)，CHR能減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、下調(diào)炎性因子表達[2-3]，并有抑制氧化應(yīng)激、減少自噬反應(yīng)的作用[19-20]。然而CHR在腦缺血再灌注損傷中發(fā)揮長期神經(jīng)保護作用的機制目前尚不完全清楚。因此，本研究應(yīng)用免疫熒光染色法觀察MCAO小鼠腦缺血再灌注后14 d缺血半暗帶區(qū)HIF-1α及VEGF蛋白的表達水平，從而進一步探究CHR發(fā)揮長期腦保護作用的機制。

HIF-1α受氧濃度的密切調(diào)控。在常氧下，HIF-1α被脯氨酰羥化酶泛素化并降解。在缺氧條件下，HIF-1α與HIF-1β形成二聚體，并激活靶基因的轉(zhuǎn)錄。缺氧是缺血性卒中的主要特征。文獻[21]報道，HIF-1α的異常表達參與缺血缺氧性疾病的發(fā)展過程，腦出血大鼠血清中的HIF-1α水平顯著高于正常大鼠。此外，處于高原地區(qū)的缺血性腦卒中患者的血清中HIF-1α表達水平明顯升高，其表達水平與腦梗死面積大小、腦損傷程度及預(yù)后有關(guān)[22]。本研究通過免疫熒光染色法觀察到在Sham組小鼠的腦組織內(nèi)中HIF-1α的表達極低，然而MCAO組小鼠腦缺血半暗帶區(qū)的HIF-1α表達水平明顯增多，提示腦缺血再灌注損傷引起HIF-1α表達增加，促進缺血性腦損傷。有文獻[23]報道，大黃可以通過下調(diào)HIF-1α的水平，降低缺氧/復(fù)氧處理后腸上皮細胞的炎癥反應(yīng)，保護腸上皮細胞。本研究的熒光染色結(jié)果顯示，給予CHR治療14天的腦缺血再灌注小鼠缺血半暗帶區(qū)內(nèi)HIF-1α蛋白表達水平比MCAO組小鼠顯著減少，且HIF-1α與NeuN共定位，提示CHR能抑制腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)元內(nèi)HIF-1α的產(chǎn)生。筆者前期研究[3]證明，CHR能顯著降低MCAO小鼠神經(jīng)元內(nèi)TUNEL陽性細胞數(shù)量。結(jié)合本研究結(jié)果，進一步提示CHR很可能通過抑制腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)元內(nèi)HIF-1α的產(chǎn)生，減少神經(jīng)元的凋亡，發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

VEGF參與腦缺血損傷后的能量代謝、血管生成、凋亡和遷移等一系列神經(jīng)損傷修復(fù)過程。研究[24]表明，VEGF可降低神經(jīng)元對傷害性刺激的反應(yīng)強度，提高細胞對缺血缺氧損傷的耐受性，進而減少損傷細胞的死亡，并促進神經(jīng)元生長和發(fā)育，發(fā)揮細胞保護效應(yīng)。本研究的免疫熒光染色結(jié)果顯示，MCAO組小鼠腦缺血半暗帶區(qū)的VEGF表達水平比Sham組明顯減少，提示VEGF的減少可能是造成腦缺血損傷的主要原因之一。研究[25]顯示，缺血預(yù)處理能夠誘導(dǎo)VEGF及其受體的大量表達，對缺血性腦損傷具有保護作用。給腦梗死大鼠注射VEGF能明顯促進缺血后損傷神經(jīng)元的修復(fù)[26]，顯著減少梗死體積[16]，表明VEGF可改善腦缺血損傷。為了進一步明確CHR拮抗腦缺血再灌注損傷的機制，筆者觀察了小鼠腦內(nèi)VEGF在神經(jīng)元中的表達。本研究結(jié)果表明，給予CHR治療的腦缺血再灌注小鼠，于再灌注14 d后，其腦缺血半暗帶區(qū)的VEGF水平比MCAO組小鼠明顯增多，且VEGF與NeuN免疫熒光共定位，提示CHR可能通過上調(diào)神經(jīng)元內(nèi)VEGF表達水平進而發(fā)揮長期的神經(jīng)保護作用。

綜上，本研究結(jié)果提示，CHR可能通過下調(diào)腦缺血再灌注損傷后缺血半暗帶區(qū)HIF-1α的水平、上調(diào)VEGF表達，保護缺血性神經(jīng)元，從而發(fā)揮長期的神經(jīng)保護作用。本研究進一步豐富了CHR改善腦缺血再灌注損傷的預(yù)后、發(fā)揮長期腦保護作用的相關(guān)機制，為臨床應(yīng)用CHR治療缺血性腦血管病提供了更多依據(jù)。