莊虔瑩 王 芹 陳 仝 楊曉葵*

(1. 首都醫(yī)科大學附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院生殖醫(yī)學科， 北京 100026； 2. 首都醫(yī)科大學附屬北京地壇醫(yī)院婦產(chǎn)科， 北京 100015)

體外受精/卵胞質(zhì)內(nèi)單精子顯微注射-胚胎移植(invitrofertilization/intracytoplasmic sperm injection-embryo transfer, IVF/ICSI-ET)已成為治療不孕癥的重要方法之一。近年來，卵巢儲備功能減退(diminished ovarian reserve, DOR)發(fā)生率逐年增加，約占不孕癥婦女的10%[1]，DOR可能是引起不孕的原因，也是影響IVF/ICSI-ET成功率的關(guān)鍵。由于DOR患者在促排卵過程中易出現(xiàn)卵巢低反應，臨床中常在促排卵前使用脫氫表雄酮(dehydroepiandrosterone, DHEA)等預處理以改善DOR患者的卵巢反應性[2]，但目前其有效性及作用機制尚不明確。生長分化因子-9(growth differentiation factor-9, GDF-9)及骨形態(tài)發(fā)生蛋白-15(bone morphogenetic protein-15, BMP-15)是調(diào)控卵泡發(fā)育的關(guān)鍵因子，可作為評估卵母細胞發(fā)育狀態(tài)的標志物[3]。本研究納入了163個促排卵周期，以分析DHEA預處理對 DOR患者卵巢儲備功能和IVF/ICSI-ET結(jié)局的影響，并進一步探討卵泡液GDF-9、BMP-15與卵巢儲備功能指標間的相關(guān)性，以期為DHEA改善IVF結(jié)局的作用機制研究提供參考思路。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2016年1月至2018年12月因輸卵管因素和(或)男方因素在首都醫(yī)科大學附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院行IVF/ICSI-ET助孕的患者。共納入163名DOR患者，所有患者均為第一次進入促排卵周期。根據(jù)預處理方案不同，將患者分為DHEA組(n=87)和對照組(n=76)。所有患者均簽署知情同意書,本研究獲得首都醫(yī)科大學附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院倫理委員會批準(倫理審批號：2016-KY-009-01)。

納入標準：(1)不孕年限≥1年；(2)符合DOR診斷標準：即滿足以下 3條中至少2條[4-5]：① 10 U/L<基礎(chǔ)卵泡刺激素(basal follicle stimulating hormone, bFSH)<25 U/L和(或)FSH/黃體生成素(luteinizing hormone, LH)>3和(或)雌二醇(estradiol, E2)>80 pg/mL；②竇卵泡數(shù)(antral follicle counts, AFC)<5～7；③抗苗勒管激素(anti-Müllerian hormone, AMH)<0.5～1.1 ng/mL。

排除標準：①反復種植失?。虎谧訉m內(nèi)膜異位癥、子宮腺肌癥；③子宮肌瘤；④多囊卵巢綜合征；⑤高泌乳素血癥；⑥卵巢或盆腔手術(shù)史；⑦合并各種肝、腎或是心血管及血液系統(tǒng)疾病，心理或精神疾病患者；⑧內(nèi)分泌及代謝疾病(如糖尿病、甲狀腺或腎上腺功能異常)；⑨近3個月內(nèi)服用類固醇激素藥物。

1.2 預處理方法

DHEA組于月經(jīng)第2～3天抽血檢測基礎(chǔ)內(nèi)分泌，并行陰道超聲計數(shù)AFC，同日起口服 DHEA(25 mg×90粒/瓶)，25 mg/次，每日3次，共8周。對照組于月經(jīng)第2～3天抽血檢測基礎(chǔ)內(nèi)分泌指標并行陰道超聲檢查AFC，促排卵前未給予任何預處理。

1.3 控制性促排卵及IVF/ICSI-ET

月經(jīng)的第 2～3 天開始每日使用促性腺激素(gonadotropin, Gn)(果納芬，德國默克雪蘭諾公司；或注射用尿促性素，中國麗珠集團麗珠制藥廠；或賀美奇，德國輝凌制藥有限公司)，根據(jù)患者年齡、AFC、激素濃度給予合適的Gn啟動用量，并通過超聲監(jiān)測及激素濃度調(diào)整Gn用量，應用B超監(jiān)測卵泡及子宮內(nèi)膜厚度。

用藥第6天或卵泡直徑達13～14 mm時，加用GnRH拮抗劑(思則凱，默克雪蘭諾公司，德國)0.25 mg/d，至人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，hCG)注射日。當至少有1個卵泡直徑達 18 mm或至少2個卵泡直徑達 17 mm 時，于當晚21:00至21:30注射hCG(艾澤，默克雪蘭諾公司，德國)250 μg，于36～38 h 后在超聲引導下經(jīng)陰道穿刺取卵。根據(jù)男方精液情況行IVF或ICSI受精。取卵后2～3 d選取1～2個優(yōu)質(zhì)胚胎行胚胎移植，胚胎移植后常規(guī)給予黃體支持治療。

1.4 妊娠結(jié)局的確定

胚胎移植術(shù)后12～14 d檢測血hCG，陽性患者繼續(xù)給予黃體支持，胚胎移植術(shù)后 30～35 d行超聲檢查，以B超顯示妊娠囊確定為臨床妊娠。

1.5 臨床資料收集與樣本收集及檢測

記錄患者一般情況、不孕年限、基礎(chǔ)內(nèi)分泌水平、AMH、AFC、Gn天數(shù)、Gn用量、hCG日激素濃度、hCG日子宮內(nèi)膜厚度、獲卵數(shù)、成熟卵數(shù)、受精率、優(yōu)胚率、胚胎種植率及臨床妊娠率。

分別收集兩組患者月經(jīng)第2～3天的血清、hCG日血清及取卵當日廢棄的卵泡液，卵泡液標本凍存于-80 ℃ 待測。

應用化學發(fā)光法測定基礎(chǔ)內(nèi)分泌及hCG日內(nèi)分泌激素濃度；應用AMH酶聯(lián)免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒檢測血清AMH。卵泡液GDF-9、BMP-15濃度使用ELISA 試劑盒進行檢測。

1.6 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 兩組病例臨床特征比較

對兩組患者的年齡、體質(zhì)量指數(shù)、不孕年限、基礎(chǔ)內(nèi)分泌水平、FSH/LH、AMH、AFC進行比較，兩組差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，詳見表1。

表1 患者一般情況比較

2.2 預處理后兩組患者卵巢儲備功能指標比較

應用DHEA預處理后，與對照組相比，DHEA組AFC明顯增加，基礎(chǔ)FSH明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。兩組E2、睪酮(testosterone, T)、LH、AMH差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，詳見表2。

表2 DHEA預處理后兩組卵巢儲備功能指標比較

2.3 兩組控制性促排卵參數(shù)及助孕結(jié)局比較

DHEA組中有21例未行胚胎移植(其中3例無可移植胚胎)，66例行胚胎移植，其中22例獲得臨床妊娠，且均為單胎妊娠；對照組中有24例未移植(其中10例無可移植胚胎)，52例移植，16例為單胎妊娠，1例單卵雙胎妊娠。兩組受精方式、Gn總量與天數(shù)、hCG日激素濃度和hCG日子宮內(nèi)膜厚度、獲卵數(shù)、成熟卵數(shù)、受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、胚胎種植率、臨床妊娠率比較，差異均無統(tǒng)計學意義，詳見表3。

表3 控制性促排卵參數(shù)及結(jié)局比較

2.4 卵泡液GDF-9、BMP-15表達比較

與對照組相比，DHEA組卵泡液BMP-15濃度明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。GDF-9在兩組卵泡液表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，詳見表4。

表4 卵泡液GDF-9、BMP-15濃度比較

2.5 GDF-9、BMP-15濃度與卵巢儲備功能指標的相關(guān)性分析

對卵泡液中GDF-9、BMP-15濃度與卵巢儲備功能指標進行了相關(guān)性分析。結(jié)果顯示，卵泡液BMP-15濃度與基礎(chǔ)E2呈正相關(guān)(P<0.05)，而與 AFC、AMH、T、FSH、LH濃度均無相關(guān)性(P>0.05)。卵泡液GDF-9濃度與AFC、AMH、基礎(chǔ)E2、T、FSH、LH濃度均無相關(guān)性(P>0.05)，詳見表5。

表5 GDF-9、BMP-15與卵巢功能指標相關(guān)性分析

3 討論

卵巢儲備功能是指卵巢皮質(zhì)中存留的卵泡數(shù)量和質(zhì)量，是反映女性生育力的重要指標，且與卵巢反應性密切相關(guān)[6-8]。本研究發(fā)現(xiàn)對DOR患者使用DHEA預處理后，卵巢儲備功能可獲得一定程度的改善，表現(xiàn)為AFC顯著增加，基礎(chǔ)FSH顯著下降。此外，卵泡液中BMP-15濃度也較對照組有所增加，卵泡液BMP-15濃度與基礎(chǔ)E2呈正相關(guān)性。

DHEA由腎上腺網(wǎng)狀帶和卵巢卵泡膜細胞產(chǎn)生，在體內(nèi)主要轉(zhuǎn)化為E2和T，同F(xiàn)SH一起參與調(diào)控卵泡生長發(fā)育。然而，DHEA對DOR患者卵巢儲備功能、卵巢反應性及妊娠結(jié)局的影響仍存在爭議。Yilmaz等[9]發(fā)現(xiàn)DHEA治療后DOR患者AMH、AFC均有明顯升高，F(xiàn)SH出現(xiàn)顯著性下降，這表明DHEA預處理后DOR患者卵巢儲備功能得到一定程度改善。而Yeung等[10]的一項隨機對照試驗認為，與對照組相比，接受DHEA預處理的DOR患者，卵巢對標準劑量促性腺激素刺激的反應和IVF結(jié)果差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。本研究顯示DHEA預處理后DOR患者AMH和基礎(chǔ)E2與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但基礎(chǔ)FSH明顯下降，AFC顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

另有研究[11]顯示，補充DHEA可以維持卵泡正常發(fā)育狀態(tài)，通過促進竇前卵泡的生長，抑制細胞的凋亡，來改善卵巢儲備和卵母細胞的數(shù)量。一項Meta分析[12]表明DHEA預處理可顯著提高卵巢低反應患者IVF-ET臨床妊娠率，并減少Gn用量。前瞻隊列研究[11]顯示，DHEA補充可改善卵巢低反應患者獲卵數(shù)、卵母細胞及胚胎質(zhì)量。本研究結(jié)果顯示，補充DHEA的DOR患者IVF周期中獲卵數(shù)、受精率、優(yōu)胚率和臨床妊娠率較對照組有一定程度的改善，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，今后尚需擴大樣本量進一步驗證。

卵泡液微環(huán)境是影響卵母細胞發(fā)育的重要因素，其內(nèi)含有的多種激素、細胞因子和代謝產(chǎn)物，對卵泡發(fā)育有重要作用。研究[13]顯示，卵泡內(nèi)的GDF-9和BMP-15是卵源性生長因子，在卵泡發(fā)育中起著重要的調(diào)控作用。GDF-9主要以自分泌、旁分泌等形式參與卵泡的發(fā)育、成熟及排卵。BMP-15具有調(diào)控卵巢局部細胞分化及增生的功能，增加顆粒細胞卵泡刺激素受體(follicle stimulating hormone receptor，F(xiàn)SHR)的表達和雌激素濃度[14]。本研究中對DOR患者使用DHEA預處理后，基礎(chǔ)FSH濃度下降，AFC增加，卵泡液BMP-15濃度也明顯升高，提示DHEA改善卵巢功能可能與卵泡液BMP-15濃度增加有關(guān)，但其具體機制仍需進一步研究。

BMP-15能夠調(diào)節(jié)顆粒細胞類固醇的生成，抑制FSH引起的孕酮產(chǎn)物釋放而不影響 FSH 引起的E2合成[15]。在顆粒細胞培養(yǎng)基中添加BMP-15可增加顆粒細胞E2的表達， BMP-15的含量與雌激素濃度呈正相關(guān)[13,16-17]。本研究DHEA預處理后卵泡液BMP-15濃度顯著升高，且BMP-15與基礎(chǔ)E2有顯著相關(guān)性。本研究中基礎(chǔ)E2雖未顯著升高，但有上升趨勢，考慮DHEA可通過提高BMP-15來影響基礎(chǔ)E2濃度，進一步調(diào)節(jié)基礎(chǔ)FSH。但由于卵泡早期FSH、E2等受多種因素調(diào)控，且因樣本量等的問題，仍需擴大樣本進一步實驗證實。

綜上所述，DHEA可通過增加AFC、降低FSH改善DOR患者的卵巢儲備功能，并可顯著升高DOR患者卵泡液BMP-15濃度。DOR患者卵泡液BMP-15表達與基礎(chǔ)E2呈正相關(guān)。但DHEA在改善臨床結(jié)局中的作用尚需要擴大樣本量進一步研究。