劉 博，陳 融，2，陳 凱，彭 鼎，2，王 米*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用化學(xué)藥物及制劑學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200241；2.長江大學(xué)，荊州 434023)

雞球蟲病是一種嚴(yán)重的寄生蟲病，可引起雞輕度至嚴(yán)重的病變，給畜牧業(yè)造成沉重負(fù)擔(dān)，長期困擾著養(yǎng)禽業(yè)，不利于經(jīng)濟(jì)的增長。據(jù)估計(jì)，世界范圍內(nèi)每年養(yǎng)殖雞群約有210億只，產(chǎn)生1.1萬億個(gè)雞蛋和約900億kg雞肉，但球蟲病會(huì)降低雞蛋和肉類的產(chǎn)量，并在全球每年造成約20億英鎊的損失[1-3]。根據(jù)球蟲的分類，不同的球蟲寄生在雞體內(nèi)不同的部位。球蟲病可以導(dǎo)致雞的營養(yǎng)損失、腸壁出血性炎癥和上皮脫落或徹底破壞，導(dǎo)致大量出血和死亡[4]。在不斷與雞球蟲病的抗?fàn)幹校藗冸m然開發(fā)出了許多有效的抗球蟲藥和球蟲病疫苗，在控制疾病方面取得了很大進(jìn)展，但是也出現(xiàn)了很多問題，比如藥物殘留和微生物耐藥性問題[5]。此外，給家禽大量使用化學(xué)類抗球蟲藥物后，一些藥物會(huì)通過排泄物原樣排泄，并可以轉(zhuǎn)移到農(nóng)田中，污染了食物來源，并對(duì)環(huán)境、植物、土壤造成了極大的污染[6]。在家禽飼料中使用化學(xué)類藥物及一些抗生素會(huì)對(duì)家禽、人類健康、食品安全及環(huán)境造成潛在的不利影響，因此，全球范圍實(shí)施了完全禁止或限制使用抗生素的方案，并尋找能在畜禽業(yè)使用的綠色安全藥物[7]。開發(fā)新的即能抗雞球蟲病又綠色安全、無污染殘留的藥物，日益受到人們的關(guān)注。

多糖是自然界中普遍存在的生物大分子，具有多種生物和藥理活性。多糖的來源非常廣泛，比如可以來源于光合作用較高的植物、真菌、藻類、細(xì)菌等，不同來源的多糖因其具有不同的的生物學(xué)活性而備受關(guān)注，如一些多糖具有抗腫瘤、抗氧化、抗糖尿病、抗輻射、抗病毒、降血脂、免疫調(diào)節(jié)等功能[8-9]。腸道微生物在食物能量的獲取、儲(chǔ)存和消耗中起著重要的作用，動(dòng)物飼料中也常常添加細(xì)菌，如添加雙歧桿菌屬、乳酸桿菌屬、球菌屬、鏈球菌屬、酵母菌株釀酒酵母和克魯維酵母屬來增加動(dòng)物的體重增長，研究表明，益生菌在促進(jìn)生長方面相當(dāng)于或優(yōu)于抗生素[10]。球蟲感染會(huì)破壞雞盲腸屏障和破壞菌群多樣性，使雞盲腸內(nèi)的乳酸桿菌的數(shù)量大量減少，同時(shí)，機(jī)會(huì)病原體也會(huì)不斷增加[11-12]。多糖可充當(dāng)益生元的角色，可以作為底物被益生菌利用，可以促進(jìn)腸道益生菌的生長[13]。另外，也有研究表明，一些多糖對(duì)小鼠體內(nèi)球蟲感染有一定的作用[14]。因此，對(duì)多糖進(jìn)行研究具有重要的意義。

多糖經(jīng)過硫酸化修飾，可以改變其結(jié)構(gòu)，進(jìn)而改變其生物活性功能，如硫酸化可以改善多糖對(duì)巨噬細(xì)胞的吞噬作用，還能改善多糖的抗氧化，抗腫瘤、抗炎的作用[15-18]。本試驗(yàn)擬探討硫酸化酵母葡聚糖(sGSC)對(duì)感染球蟲的雞的影響，通過分析雞的體重、臟器指數(shù)、卵囊排除情況及腸道菌群變化，以探究sGSC是否具有抗球蟲的作用，是否具有被開發(fā)為抗球蟲藥物的潛力，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

浦東三黃小公雞，購自上海匯中種雞場，1日齡購入， 飼養(yǎng)在經(jīng)過嚴(yán)格消毒的無球蟲房間，14 d后開始分組。全價(jià)飼料委托上海祥興有限公司加工,飼料中不添加任何藥物。飲水為RO 水(reverse osmosis water)。

1.2 蟲株

柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊(Eimeriatenella)，由本研究室自備，4 ℃冰箱保存。

1.3 葡聚糖的準(zhǔn)備

硫酸化酵母葡聚糖，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所獸用抗感染藥物團(tuán)隊(duì)所制。

1.4 分組與處理

200只雞隨機(jī)分為A、B、C、D和E組，每組4籠， 每籠10只雞。分組完成后，A、B、C組分別在飲水中添加sGSC，用量分別為 4、16、和64 mg· kg-1，D組和E組飲用RO水，連續(xù)3 d后，除了E組, 對(duì)其余各組雞只人工經(jīng)口感染柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊(每只雞經(jīng)口灌入卵囊1 mL，每毫升包含3萬個(gè)孢子化卵囊)。

1.5 臨床觀察

試驗(yàn)期間每日觀察各組雞的精神狀態(tài)、飲食飲水情況、有無血便、有無死亡等情況，并準(zhǔn)確記錄下來。如果試驗(yàn)期間出現(xiàn)雞死亡，應(yīng)進(jìn)行解剖，觀察其病理變化，判斷其死亡原因[19]。

1.6 感染雞的卵囊檢查

感染后第4天清除各組雞的糞便，換上新的報(bào)紙，收集第5、6天的糞便，收集的糞便按組別混合攪拌均勻，分別稱取2 g糞便至燒杯中，加水稀釋至60 mL， 攪拌均勻，各取1 mL稀釋液后加入2 mL飽和鹽水，振蕩混勻后充入麥克馬氏計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)室，靜止3 min后在顯微鏡下計(jì)數(shù)，計(jì)算每克糞便中的卵囊數(shù)，計(jì)算公式為OPG= [(n1+n2)/(2×0.15)]×3×60÷2。

1.7 器官指數(shù)分析

感染后第7天對(duì)每只雞稱重，剖殺所有雞，觀察盲腸病變，計(jì)算心、肝、胸腺和法氏囊的臟器指數(shù)，計(jì)算公式: 器官指數(shù)= 器官鮮重/宰前活重×100%。

1.8 腸道菌群分析

腸道內(nèi)容物的DNA提取和高通量測序。剖殺雞后，從每組中取3只雞，在無菌條件下分別取其盲腸，分離腸道內(nèi)容物，從盲腸中提取總微生物DNA，通過PCR擴(kuò)增16S rRNA基因的V3-V4區(qū)域，然后在Illumina MiSeq / NovaSeq平臺(tái)上測序。本工作由上海派森諾公司完成。

1.9 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié) 果

2.1 臨床表現(xiàn)情況

D組雞在感染球蟲第3天出現(xiàn)精神萎靡，羽毛凌亂現(xiàn)象，采食量明顯減少，感染后第4天下午出現(xiàn)血便；第5天血便更加嚴(yán)重，雞群呈現(xiàn)精神沉郁和嗜睡等癥狀。此外，試驗(yàn)期間，A、B、C、D 4組各死亡1只， 對(duì)每只死雞進(jìn)行剖檢，發(fā)現(xiàn)腸道出現(xiàn)病變，盲腸內(nèi)出現(xiàn)血液或血樣凝塊和盲腸顯著萎縮，腸黏膜變厚。E組雞的精神狀況良好，糞便顏色正常，無死亡。

2.2 體重變化分析

由圖1可知，球蟲感染后，D組中雞的終末體重表現(xiàn)為明顯降低，與E組相比差異極顯著(P<0.01)。 飲水中添加sGSC的各組雞中，A組(4 mg·kg-1) 雞的體重顯著低于E組(P<0.05)，B組(16 mg·kg-1)和C組(64 mg·kg-1)中雞的體重有所恢復(fù)，雞體重與E組體重?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)， 說明恢復(fù)至接近E組水平。

2.3 卵囊排出情況

由于E組雞未排出卵囊，故對(duì)A、B、C、D 4組進(jìn)行分析。由圖2可以看出，感染后第5天，A組(4 mg·kg-1) 與D組排出卵囊數(shù)相近，而B組(16 mg·kg-1) 和C組(64 mg·kg-1)雞排出的卵囊數(shù)較低，其中，C組(64 mg·kg-1)排出的卵囊數(shù)最少。感染后第6 天，A、B、C、D 4組的卵囊數(shù)逐漸接近。各組雞排出卵囊的變化在統(tǒng)計(jì)學(xué)上均無明顯差異(P>0.05)。

A、B、C、D、E后面的數(shù)字1、2、3分別代表初始雞體重、攻蟲時(shí)雞體重和終末雞體重。*代表P<0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，**代表P<0.01有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，***代表P<0.001有極顯著差異，沒有*代表無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，下圖同The numbers 1, 2, and 3 behind A, B, C, D, and E represent the initial weight of the chicken, the weight of the chicken at the time of attack, and the weight of the final chicken, respectively. * means P<0.05, there is a statistical difference, ** means P<0.01, there is a significant statistical difference, *** means P<0.001, there is a very significant difference, no* means no statistical difference, the same as below圖1 sGSC對(duì)雞體重的影響Fig.1 The effects of sGSC on chicken body weight

圖2 sGSC對(duì)雞卵囊排出的影響Fig.2 The effect of sGSC on the excretion of chicken oocysts

2.4 臟器指數(shù)分析

對(duì)各組雞的臟器指數(shù)進(jìn)行分析。由圖3可知，與E組相比，球蟲感染后導(dǎo)致D組的雞出現(xiàn)肝指數(shù)、脾指數(shù)顯著升高(P<0.05)，但胸腺指數(shù)顯著降低(P<0.05),而心和法氏囊指數(shù)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上均無明顯變化。與D組相比，除了B組(16 mg·kg-1)的肝指數(shù)有所降低(P<0.05)，其余組的臟器指數(shù)無明顯差異(P>0.05)。此外，與D組相比，A組(4 mg·kg-1) 中雞的胸腺指數(shù)明顯升高(P<0.05)，趨向于恢復(fù)至健康對(duì)照組的水平。

圖3 sGSC對(duì)雞臟器指數(shù)的影響Fig.3 The effects of sGSC on the organ index of chicken

2.5 盲腸菌群變化分析

在本研究中，通過Illumina系統(tǒng)分析了腸道菌群多樣性。稀疏曲線的平緩程度反映了測序深度對(duì)于觀測樣本多樣性的影響大小，曲線越平緩，表明測序結(jié)果已足夠反映當(dāng)前樣本所包含的多樣性，稀疏曲線圖4a表明，每個(gè)樣品均可以完全捕獲腸道菌群的測序深度，均可以用于進(jìn)一步分析。以Chao1、Observed species指數(shù)表征豐富度，Shannon指數(shù)表征多樣性，Pielou’s evenness指數(shù)表征均勻度，進(jìn)行了分析，各指數(shù)數(shù)值越大，則說明物種豐富度越高、數(shù)量越多、或物種分布越均勻。圖4c 分析了Chao1指數(shù)、Pielou_e指數(shù)、Observed_species指數(shù)和Shannon指數(shù)，發(fā)現(xiàn)各指數(shù)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上均無明顯差異(P>0.05)。用主坐標(biāo)分析(PCoA)對(duì)各組菌群進(jìn)行分析，圖4b中左下角最小三角形代表E組，與E組相比，其余各組在橫坐標(biāo)上的投影與E組距離基本相等，但A、B、C組與D組在縱坐標(biāo)上的投影有所不同，說明SGSC對(duì)雞腸道菌群產(chǎn)生了影響。

在科的水平上，對(duì)各組雞盲腸微生物的分類學(xué)組成變化進(jìn)行了分析，在科的水平上，比較有代表意義的菌群變化主要有Veillonellaceae、Lactobacillaceae和Enterococcaceae(表1和圖4 d)。結(jié)果顯示，sGSC能提高盲腸內(nèi)Veillonellaceae和Lactobacillaceae的相對(duì)豐度，降低Enterococcaceae的相對(duì)豐度，表明sGSC對(duì)雞盲腸內(nèi)的微生物結(jié)構(gòu)組成產(chǎn)生了有利的改變。

3 討 論

家禽主要用于生產(chǎn)供人食用的肉和蛋，其中，雞是最重要的家禽之一，在全球范圍內(nèi)被人們廣泛飼養(yǎng)，雞能提供動(dòng)物源性蛋白質(zhì)，在改善人們的營養(yǎng)方面發(fā)揮出了巨大的作用，在世界經(jīng)濟(jì)發(fā)展中具有極其重要的地位[20]。球蟲病嚴(yán)重威脅家禽業(yè)，在全世界范圍內(nèi)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失，全球每年由球蟲病造成的經(jīng)濟(jì)損失估計(jì)為30億美元，由于抗生素和一些化學(xué)藥物具有負(fù)面作用，研發(fā)新型綠色安全的抗球蟲藥物尤為重要[21]。

球蟲感染對(duì)雞的生理狀況帶來巨大的影響，會(huì)使雞的精神狀態(tài)下降，體重減輕，采食量下降，柔嫩艾美耳球蟲還能造成腸損傷，削弱腸屏障的完整性，也能改變雞腸道內(nèi)的致病菌和非致病菌[21-22]。球蟲感染會(huì)在雞腸道內(nèi)產(chǎn)生高水平的氧化和炎性應(yīng)激，嚴(yán)重影響雞的生長發(fā)育，甚至造成死亡[23]。雞胃腸道中的微生物群能提高從飲食中獲取能量的效率，具有重要的作用，肉雞盲腸和空腸中的菌群具有極高飼料轉(zhuǎn)化能力，能間接影響雞的體重[24]。葡聚糖具有抗炎、抗氧化、提高免疫力和改善腸道菌群的作用[25-27]，因此，預(yù)測sGSC或具有一定的抗球蟲作用。在本試驗(yàn)中，將sGSC提前3 d飲水飼喂雞，持續(xù)至結(jié)束，探究提前飲水飼喂sGSC對(duì)柔嫩艾美耳球蟲感染的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，sGSC能改善柔嫩艾美耳球蟲感染對(duì)雞的影響，表現(xiàn)為減輕了受感染雞盲腸的病理變化，使血便減少，給糖濃度為16和64 mg·kg-1體重時(shí)，雞排出卵囊數(shù)出現(xiàn)減少，同時(shí)sGSC也促進(jìn)了受感染雞體重的恢復(fù)，并改善了胸腺指數(shù)和脾指數(shù)。

a.稀疏曲線；b. PCoA分析；c.α多樣性分析；d.物種組成分類分析a. Sparse curve; b. PCoA analysis; c. α diversity analysis; d. Species composition classification analysis圖4 sGSC對(duì)雞盲腸內(nèi)微生物的影響Fig.4 The effects of sGSC on the microbes in the cecum of chickens

表1 每組盲腸內(nèi)細(xì)菌組成在科水平上的不同

本研究對(duì)雞盲腸內(nèi)微生物變化也進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，柔嫩艾美耳球蟲感染使雞盲腸內(nèi)的Veillonellaceae相對(duì)豐度減少為0，而給糖濃度為4 mg·kg-1時(shí)，A組中盲腸內(nèi)Veillonellaceae的相對(duì)豐度提升至0.2%，但仍然低于E組的0.74%。有研究表明，Veillonellaceae是一種有益的細(xì)菌，營養(yǎng)不良的病人腸道中Veillonellaceae豐度會(huì)減少，Veillonellaceae也可以將琥珀酸酯轉(zhuǎn)化為丙酸酯，影響丙酸的形成及糖酵解[28]。Lactobacillaceae是一種益生菌[29]，感染柔嫩艾美耳球蟲后，雞盲腸內(nèi)Lactobacillaceae豐度降低為0，但是在給糖濃度為16 mg·kg-1時(shí)，Lactobacillaceae豐度則恢復(fù)至0.27%，但仍低于E組的8.37%。Enterococcaceae與發(fā)熱和腹瀉有關(guān)，危害比較嚴(yán)重[30]，在本研究中，E組Enterococcaceae豐度為0.感染對(duì)照組Enterococcaceae豐度為11.94%，A、B、C等給糖組的Enterococcaceae相對(duì)豐度分別降為0.92%、0.71% 和4.73%，說明sGSC減少了雞盲腸中Enterococcaceae的相對(duì)豐度。以上結(jié)果均可說明，sGSC對(duì)雞腸道菌群具有有益的調(diào)節(jié)作用。

4 結(jié) 論

sGSC能改善柔嫩艾美耳球蟲感染對(duì)雞群帶來的不利影響，并且對(duì)感染雞的腸道菌群具有一定的調(diào)節(jié)作用。