李淑雅，黃 贊，朱偉云，林 焱

(國家動物消化道營養(yǎng)國際聯(lián)合研究中心，江蘇省消化道營養(yǎng)與動物健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)消化道微生物研究室，南京 210095)

奇異變形桿菌是革蘭陰性菌，屬于腸桿菌科變形桿菌屬，廣泛分布于動物的腸道中，是一種條件致病菌。奇異變形桿菌具有鞭毛、菌毛、尿素酶、外膜蛋白等毒力因子，可以黏附到宿主黏膜表面對宿主產(chǎn)生損傷[1]。自1989年江益民等[2]首次從雞中分離出奇異變形桿菌以來，我國陸續(xù)有雞[3]、水貂[4]、山羊[5]、豬[6]等感染的報道。奇異變形桿菌會引起豬腹瀉、體溫升高、腸道和肺部病變，并且有一定致死性[7]。除此之外，奇異變形桿菌還是一種人畜共患病病原，會引起人的尿路感染[8]。由于會給畜牧生產(chǎn)和人類健康帶來不利影響，造成經(jīng)濟(jì)損失，對奇異變形桿菌的防控不容忽視。

噬菌體(bacteriophage)是能夠感染細(xì)菌的病毒，廣泛分布于細(xì)菌存在之處，例如，土壤和動物的腸道中。依據(jù)遺傳物質(zhì)可將噬菌體分為雙股DNA群(dsDNA)、單股DNA群(ssDNA)、雙股RNA(dsRNA)、單股RNA群(ssRNA)。依據(jù)形態(tài)，雙股DNA群下將噬菌體分為肌尾噬菌體(Myoviridae)、短尾噬菌體(Podoviridae)、長尾噬菌體(Siphoviridae)等[9]。在短尾噬菌體中，C3樣的噬菌體較為少見，在此前的電鏡觀察中，5 500株噬菌體中只觀察到了0.5%的C3樣噬菌體[10]。C3樣噬菌體中最具代表性的是大腸桿菌噬菌體phiEco32[11]，并以此命名了phiEco32屬。目前，根據(jù)國際病毒分類委員會主要物種列表2019.v1(ICTV Master Species List 2019.v1)，以phiEco32為代表種的phiEco32屬已被命名為Kuravirus屬。Kuravirus屬下還包括了大腸桿菌噬菌體172-1[12]、ECMP2[13]、NJ01[14]、Septima11(NC_023593)、SU10[15]等種。除此之外，沙門菌噬菌體7-11[16]、阪崎腸桿菌噬菌體vB_CsaP_GAP52(NC_019402.1)、副溶血性弧菌噬菌體Vp_R1[17]也被歸為Kuravirus屬，但未被收錄到國際病毒分類委員會主要物種列表中。目前，僅發(fā)現(xiàn)1株C3樣的革蘭陽性菌噬菌體：乳酸乳球菌噬菌體KSY1，它的基因組與其他C3樣噬菌體沒有同源性[18]。

目前，對于奇異變形桿菌感染仍多采用抗生素進(jìn)行預(yù)防和治療，但廣譜抗生素的使用已導(dǎo)致嚴(yán)重的負(fù)面效應(yīng)。近年來，已有研究報道奇異變形桿菌對不同抗生素產(chǎn)生耐藥性，并且產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)菌株比例逐漸上升[19]，產(chǎn)生多重耐藥性。此外，2020年，我國已全面禁止在飼料中添加抗生素，尋找安全有效的抗生素替代品成為當(dāng)務(wù)之急。烈性噬菌體作為感染細(xì)菌的病毒，有嚴(yán)格的宿主特異性、能夠自我復(fù)制等優(yōu)勢，成為最有潛力的抗生素的替代品之一。

本文從斷奶前仔豬和健康斷奶仔豬糞樣中分離到1株C3樣的奇異變形桿菌噬菌體，對其生物學(xué)特性和基因組進(jìn)行研究，為防治奇異變形桿菌感染提供一定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及噬菌體來源 用于噬菌體分離的菌株奇異變形桿菌(Proteusmirabilis)，為南京農(nóng)業(yè)大學(xué)消化道微生物實(shí)驗(yàn)室從健康豬糞樣中分離得到，NCBI登錄號為MH643694。

用于噬菌體分離的10份樣品來源于安徽滁州某豬場5頭斷奶前與5頭斷奶后仔豬糞樣。

1.1.2 主要試劑與培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基中酵母膏及胰蛋白胨購自O(shè)XOID，瓊脂粉購自Solarbio，NaCl購自南京強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司；SM緩沖液購自生工生物工程(上海)股份有限公司；0.22 μm一次性針頭濾器購自Millipore；限制性核酸內(nèi)切酶購自TaKaRa公司。

1.2 噬菌體分離純化

采用雙層平板法對噬菌體進(jìn)行分離。將1 g糞樣用20 mL SM液稀釋，12 000 r·min-1離心10 min去除雜質(zhì)，將上清過濾除菌。將100 μL濾液與100 μL 處于對數(shù)期的宿主菌混合后，加入5 mL LB半固體培養(yǎng)基中，倒雙層平板。將雙層平板置于37 ℃ 培養(yǎng)5～6 h，觀察有無噬菌斑。挑取單個噬菌斑反復(fù)純化3次，即可獲得單一噬菌體。

1.3 噬菌體基因組的提取和酶切鑒定

參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》[20]提取噬菌體基因組。使用限制性核酸內(nèi)切酶Hind Ⅲ、BamHⅠ、XhoⅠ、EcoRⅠ、SacⅠ酶切后，用1%凝膠電泳觀察成像并分析。

1.4 噬菌體形態(tài)觀察

噬菌體培養(yǎng)液經(jīng)0.22 μm濾器過濾后，用100 kDa超濾管濃縮至濃度為109～1010PFU·mL-1，送南京農(nóng)業(yè)大學(xué)電鏡室采用磷鎢酸溶液染色法進(jìn)行形態(tài)觀察。

1.5 噬菌體生物特性分析

1.5.1 噬菌體最佳感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI) 測定 將噬菌體以感染復(fù)數(shù)100∶1、10∶1、1∶1、1∶10、1∶100、1∶1 000、1∶10 000、1∶100 000 分別接種至處于對數(shù)期的宿主菌中，37 ℃ 培養(yǎng)4.5 h，得到噬菌體滴度最高的MOI為最佳MOI。

1.5.2 噬菌體一步生長曲線及抑菌曲線繪制 按照最佳MOI將噬菌體和宿主菌接入LB培養(yǎng)基中，37 ℃孵育15 min后4 000 r·min-1離心5 min，倒掉上清以去除未吸附的噬菌體，再用LB培養(yǎng)基重懸菌體。迅速置于37 ℃、120 r·min-1震蕩培養(yǎng)6 h。在一定時間點(diǎn)取樣，以時間為橫坐標(biāo)，以噬菌體滴度為縱坐標(biāo)繪制噬菌體生長曲線。以時間為橫坐標(biāo)，OD600 nm為縱坐標(biāo)，并以宿主菌作為對照繪制抑菌曲線。

1.5.3 噬菌體熱穩(wěn)定性及pH穩(wěn)定性 將0.9 mL SM緩沖液置于30、40、50、60、70、80 ℃預(yù)熱后，加入0.1 mL滴度為109PFU·mL-1噬菌體，使終濃度為108PFU·mL-1。在30、60 min時分別取樣，以雙層平板法檢測效價。

取0.1 mL滴度為109PFU·mL-1的噬菌體培養(yǎng)液與0.9 mL pH為2～13的SM緩沖液混合，37 ℃ 培養(yǎng)3 h后，以雙層平板法進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.6 噬菌體全基因組測序及組學(xué)研究

噬菌體序列測定由上海凌恩科技公司完成。

噬菌體基因組分析使用GeneMarkS(版本：4.6b，http://topaz.gatech.edu/GeneMark/)預(yù)測編碼基因。使用 BLAST在線工具(http://blast. ncbi.nlm.nih.gov /) 進(jìn)行堿基序列相似性比對及編碼基因的注釋。最后將基因組上傳至NCBI獲得序列號。

使用ARAGORN (http://130.235.244.92/ARAGORN/)確定基因組中是否存在tRNA。使用VFDB(http://www.mgc.ac.cn/VFs/main.htm)進(jìn)行毒力基因分析，使用CARD數(shù)據(jù)庫(https://card.mcmaster.ca/home)進(jìn)行抗生素抗性分析。使用MEGA X繪制進(jìn)化樹。

2 結(jié) 果

2.1 噬菌體的分離鑒定

2.1.1 噬菌體的分離純化及鑒定 從2份斷奶前糞樣以及4份斷奶后糞樣中均分離得到噬菌體，將從這6份樣品中分離得到的噬菌體分別提取基因組，進(jìn)行酶切鑒定，酶切結(jié)果顯示6個噬菌體酶切條帶一致，酶切結(jié)果如圖1A所示，故判定為同一株噬菌體，將其命名為奇異變形桿菌噬菌體vB_PmiP_P59(Proteusmirabilisphage vB_PmiP_P59)，簡稱為P59。噬菌斑大小均一，直徑約為1 mm，邊緣不整齊，如圖1B。

2.1.2 噬菌體分類鑒定 電鏡結(jié)果(圖1C)表明，P59頭部為扁平的橢圓形，長152 nm，寬54 nm；尾部大小約40 nm×12 nm，尾部長度小于頭部寬度，推斷P59屬于短尾病毒科(Podoviridae)；頭部長度超過寬度數(shù)倍，根據(jù)Ackermann和Eisenstark[21]的分類方法推斷其為C3樣噬菌體。

2.2 噬菌體的生物學(xué)特性

2.2.1 最佳感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI) 測定 如圖2A，噬菌體P59在MOI為10-3時獲得的噬菌體效價最高，為2.2×1010PFU·mL-1。

2.2.2 噬菌體一步生長曲線及抑菌曲線繪制 以時間為橫坐標(biāo)，噬菌體滴度為縱坐標(biāo)繪制噬菌體一步生長曲線。生長曲線如圖2B所示，P59的潛伏期為30 min，爆發(fā)時間為105 min，裂解量=爆發(fā)末期噬菌體滴度/感染初期宿主菌濃度=2 754 PFU·cell-1。

抑菌曲線如圖2C所示，P59對奇異變形桿菌有顯著抑菌效果(P<0.05)。

2.2.3 噬菌體的熱穩(wěn)定性及pH穩(wěn)定性 如圖2D，噬菌體P59在pH 5～10效價保持穩(wěn)定；在pH為4時，存活率下降了一個數(shù)量級；pH為11時，完全失去活性。

如圖2E，噬菌體P59經(jīng)過30～50 ℃處理30、60 min時效價均保持穩(wěn)定；60 ℃處理30 min時效價保持穩(wěn)定，處理60 min后效價顯著降低(P<0.05)，70 ℃處理30 min后已失去活性。

A.噬菌體P59基因組酶切圖(泳道1和2分別為15000 marker和糞中分離得到的噬菌體)；B. 噬菌體P59噬菌斑形態(tài)；C.噬菌體P59電鏡形態(tài)A. Electrophoresis of phage P59’s genome digested with restriction endonucleases (Lane 1. 15000 marker; Lane 2. phage isolated from fecal); B. Plaques of phage P59; C. Electron micrograph of phage P59圖1 噬菌體P59的分離鑒定Fig.1 Isolation and identification of P59

A. 最佳MOI；B.一步生長曲線；C.抑菌曲線；D. pH穩(wěn)定性；E. 熱穩(wěn)定性。圖中所標(biāo)字母相異代表各處理組差異顯著(P<0.05)， 字母相同代表各處理組差異不顯著(P≥0.05)。下圖同A. Optimal MOI of phage P59; B. One-step growth curve of phage P59; C. Bactericidal curve of phage P59; D.Thermal stability of phage P59; E. pH stability of phage P59. Different letters denote significant difference between the treatments(P<0.05), the same letter denotes no significant difference between treatments(P≥0.05). The same as below圖2 噬菌體P59的生物學(xué)特性Fig.2 Biological characteristics of phage P59

2.3 噬菌體基因組學(xué)研究

2.3.1 噬菌體全基因組概況 噬菌體基因組為線形雙鏈DNA，長度為90 187 bp，(G+C)%含量為34.65%。將噬菌體全基因組核酸序列提交GenBank，獲取的登錄號為MT664722。根據(jù)BLASTn比對，與1株奇異變形桿菌噬菌體Privateer(90 710 bp，MT028297.1)和1株阪崎腸桿菌vB_CsaP_009(92 122 bp，NC_048664.1)相似性較高，分別為95.06%、96.52%，覆蓋率分別為96%、91%。

噬菌體基因組中tRNA的作用是編碼宿主中較少出現(xiàn)的密碼子以增加噬菌體蛋白的表達(dá)[22]。經(jīng)過ARAGORN分析，P59基因組中有4個tRNA基因存在，分別為tRNA-Trp(CCA)、tRNA-Arg(TCT)、tRNA-Met(CAT)、tRNA-Arg(CCT)。其他Kuravirus屬噬菌體基因組均含有Arg-tRNA (TCT)，但該tRNA在大腸桿菌噬菌體基因組中較為罕見。

經(jīng)過VFDB對比分析噬菌體P59中沒有發(fā)現(xiàn)毒力因子的編碼基因，經(jīng)過CARD分析未發(fā)現(xiàn)攜帶耐藥基因，表明該噬菌體具有較好的生物安全性。

2.3.2 噬菌體功能性O(shè)RF分析 利用GeneMarkS(版本：4.6b，http://topaz.gatech.edu/GeneMark/)進(jìn)行初步預(yù)測，共發(fā)現(xiàn)136個開放閱讀框(ORF)。與其他Kuravirus屬噬菌體相似，P59的ORF絕大多數(shù)以AUG作為起始密碼子，達(dá)到90.44%；12個ORF以GUG開頭(8.82%)；1個以UUG開頭(7.35%)。

使用BLASTp中的Nr數(shù)據(jù)庫將預(yù)測基因的蛋白序列進(jìn)行對比，獲得預(yù)測基因的注釋信息。其中，已知功能的32個ORF如表1所示。噬菌體基因組可分為4個功能模塊，包括噬菌體結(jié)構(gòu)蛋白，DNA復(fù)制和修飾、核苷酸修飾與調(diào)節(jié)，以及其他功能基因(圖3)。與噬菌體形態(tài)相關(guān)的8個ORF包括ORF17(末端酶大亞基)、ORF18(門戶蛋白)、ORF20(支架蛋白)、ORF21(衣殼和支架蛋白)、ORF22(淀粉結(jié)合蛋白)、ORF28(結(jié)構(gòu)蛋白)、ORF30(宿主特異性蛋白J)、ORF34(DNA注射蛋白)。與DNA復(fù)制相關(guān)的8個ORF包括ORF41(核酸內(nèi)切酶)、ORF54(DNA連接酶)、ORF56(核酸外切酶)、ORF58、72、86(DNA聚合酶)、ORF82(DNA結(jié)合蛋白)、ORF87(引物酶/解旋酶)。與核苷酸合成和修飾相關(guān)的7個ORF包括ORF43(腺嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶)、ORF50(煙酰胺核糖核酸)、ORF81、94、96(脫氧核糖核苷酸還原酶)、ORF85(dCTP脫氨酶)、ORF128(煙酰胺磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶)、ORF129(磷酸核糖焦磷酸激酶)。ORF81、94、96參與編碼的脫氧核糖核苷酸還原酶(RNR)，是輔助代謝基因(AMGs)的一種，能支持宿主被感染過程中的代謝，從而促進(jìn)噬菌體的復(fù)制和修復(fù)[23]。

ORF58編碼RNA聚合酶ECF sigma 因子，該因子在phiEco32、7-11、Vp_R1、SU10等其他Kuravirus屬噬菌體中均有發(fā)現(xiàn)，能夠識別病毒中晚期基因的啟動子[24]。ORF113可以產(chǎn)生活性物質(zhì)內(nèi)溶素，內(nèi)溶素是一種裂解酶，可與穿孔素共同作用于細(xì)胞壁和細(xì)胞膜使宿主菌破裂，釋放子代噬菌體[25]。除此之外，未在P59基因組中發(fā)現(xiàn)整合酶序列，說明P59是1株烈性噬菌體。

2.4 進(jìn)化樹構(gòu)建

支架蛋白是C3樣的噬菌體基因組中較為保守的部分，通常用于分類[15]。使用MEGA X軟件，采用鄰接法對P59以及其他9株C3樣噬菌體的支架蛋白構(gòu)建進(jìn)化樹。如圖4，進(jìn)化樹演化出了兩個分支，在支架蛋白上與P59進(jìn)化距離最近的是沙門菌噬菌體7-11和阪崎腸桿菌噬菌體GAP52。

3 討 論

作者從健康仔豬的糞樣中分離出1株奇異變形桿菌的噬菌體P59。動物和人的腸道內(nèi)存在大量噬菌體，這些內(nèi)源性噬菌體能夠消滅宿主菌，同時，在腸道內(nèi)發(fā)揮免疫作用，幫助控制局部炎癥和自身免疫反應(yīng)[26]。因此，推測內(nèi)源性的P59在保護(hù)仔豬腸道健康方面也發(fā)揮了積極的作用。

P59核酸類型為線形雙鏈DNA，基因組大小為90 187 bp?；蚪M中含有136個ORF，編碼4個tRNA。P59的支架蛋白、末端酶大亞基、門戶蛋白等與噬菌體形態(tài)相關(guān)的蛋白均與C3樣噬菌體蛋白有較高的同源性。C3樣噬菌體代表株phiEco32含有的關(guān)于核苷酸合成和DNA復(fù)制的蛋白，除ATP結(jié)合蛋白、胸苷酸合成酶、HNH核酸內(nèi)切酶之外，在P59中也均有發(fā)現(xiàn)。根據(jù)Lavigne等[27]的分類方法，可以依據(jù)全基因組蛋白質(zhì)組學(xué)分析的結(jié)果對短尾噬菌體進(jìn)行分類，當(dāng)40%的蛋白質(zhì)具有同源性時，可以將2株噬菌體歸為同一屬。使用CoreGenes3.5將P59的蛋白質(zhì)組與 phiEco32進(jìn)行比對。將BLASTp分?jǐn)?shù)設(shè)置為50時，有53個蛋白(41.41%)有同源性。將BLASTp分?jǐn)?shù)設(shè)置為75時，P59與phiEco32有39個蛋白(30.47%)具有同源性，說明這兩株噬菌體可能屬于同一亞科而非同一屬。基于形態(tài)學(xué)特征和基因組特征，噬菌體P59屬于短尾噬菌體科，具有C3樣形態(tài)特征。

表1 噬菌體P59編碼的功能蛋白

(續(xù)表1 Continued)

箭頭方向代表轉(zhuǎn)錄方向?！鞔硎删w結(jié)構(gòu)蛋白；☆代表DNA復(fù)制和核苷酸代謝蛋白；○代表其他功能蛋白；灰色代表假想蛋白The direction of each arrow represents the direction of transcription. △ represent the phage structural proteins. ☆ represent phage DNA metabolism and modification proteins. ○ represent other proteins. Grey arrows represent hypothetical proteins圖3 P59的基因組結(jié)構(gòu)示意圖Fig.3 Genome structure of phage P59

進(jìn)化樹基于鄰接法構(gòu)建。數(shù)字代表置信水平，標(biāo)尺代表遺傳距離。黑色圓點(diǎn).P59。括號內(nèi).序列號The tree was inferred using the Neighbor-Joining method. Numbers at the branch point represent the confidence level. Scale represents the genetic distance. Black ball. P59. In brackets. Accession No.圖4 基于P59和其他C3樣噬菌體支架蛋白構(gòu)建同源進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree based on the scaffolding proteins between P59 and other C3 phages

噬菌體在自然界中廣泛存在，可以特異性地裂解宿主菌，還具有高度穿透性，可以通過體內(nèi)的腸道黏膜屏障、血腦屏障等[28]。隨著抗生素的濫用，致病菌的耐藥菌株大量出現(xiàn)，噬菌體的治療價值開始得到重視。但噬菌體的宿主特異性使其抑菌譜狹窄，應(yīng)用上存在局限性，因此多采用噬菌體雞尾酒(phage cocktail)療法制成混合制劑來拓展抑菌譜, 也降低所有噬菌體都產(chǎn)生突變的可能性[29]。目前，一些公司已有噬菌體雞尾酒產(chǎn)品用于畜牧生產(chǎn)上細(xì)菌感染的防治，但相關(guān)研究多針對沙門菌[30]、大腸桿菌[31]、空腸彎曲桿菌[32]等致病菌的噬菌體，對于條件致病菌噬菌體的關(guān)注較少。條件致病菌在宿主抵抗力低下時會產(chǎn)生致病性，危害宿主健康。仔豬在斷奶期間易產(chǎn)生應(yīng)激，抵抗力較差，易被條件致病菌感染，導(dǎo)致腹瀉。因此，可在這些雞尾酒制劑中再加入一些條件致病菌的噬菌體，可能會有更好的防治細(xì)菌感染的效果。生物學(xué)特性分析表明P59有較好的抑菌能力，同時最佳感染復(fù)數(shù)小，裂解量大，爆發(fā)時間長，有一定的溫度和pH穩(wěn)定性，未攜帶抗生素抗性基因和毒力基因，說明P59有一定的應(yīng)用前景，可用于奇異變形桿菌感染的預(yù)防和治療。除此之外，有研究表明，噬菌體內(nèi)溶素可作用的范圍比噬菌體的宿主譜更廣[33]，不易使細(xì)菌產(chǎn)生抗性突變株，具有廣闊的應(yīng)用前景。噬菌體P59可產(chǎn)生內(nèi)溶素，其內(nèi)溶素純化后可能也具備應(yīng)用于治療細(xì)菌感染的潛力。

4 結(jié) 論

分離到1株C3樣奇異變形桿菌噬菌體vB_PmiP_P59，最佳感染復(fù)數(shù)為0.001，潛伏期為30 min，爆發(fā)期為105 min，裂解量為2 754 PFU·cell-1，在溫度小于50 ℃，pH為5～10時穩(wěn)定。P59對宿主菌有較好的抑菌效果，有一定的應(yīng)用潛力。