邵 琰 牟微娜 俞瑩瑩

雖然膿毒癥的診斷和治療已經(jīng)取得一定進展，但總的死亡率仍然保持在30%～40%左右[1]。在膿毒癥的發(fā)展過程中，肝臟在清除細菌和產(chǎn)生炎癥介質的防御反應中起著重要作用。然而，肝臟也是炎癥反應失調(diào)的靶點，肝功能障礙預示著更糟糕的結果[2]。以往研究表明，環(huán)氧化酶-2（COX-2）/NF-E2 相關因子2（Nrf2）信號通路是免疫防御膿毒癥的重要途徑，并負責細胞完整性、功能和免疫應答的調(diào)節(jié)，可以降低感染性損傷的發(fā)病率和死亡率[3]。山茱萸是傳統(tǒng)中藥，有補益肝腎，收斂固澀功效。最新研究表明，山茱萸具有增強免疫和抗氧化活性的作用[4]。本研究探討山茱萸提取物對膿毒癥誘導的大鼠肝損傷的干預作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 60 只SPF 級雄性SD 大鼠購自華中科技大學實驗動物中心，8～10 周齡，體質量200～230g，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（鄂）2019-0005，動物使用許可證號：SYXK（鄂）2019-0033，動物質量合格證號：SDYC-201913697，在相對濕度55%，溫度25℃，自然光照，自由進食、進水的環(huán)境下飼養(yǎng)。本研究經(jīng)過浙江省臺州市中心醫(yī)院倫理委員會審核備案，批件號：（倫審）202001004 號。

1.2 主要試劑 山茱萸提取物（原料藥，純度99%，西安品健生物科技有限公司，批號77-52-3），將山茱萸提取物和生理鹽水配制成濃度分別為：0.4、0.8、1.2g/mL 的溶液；烏司他丁注射液（廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司，規(guī)格：1mL:5 萬U，批號20191209）；蘇木精-伊紅（HE）染色液、聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（上海碧云天生物技術研究所，批號分別為C0107、SF-1437）；丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉移酶（AST）和膽紅素（BIL）檢測試劑盒（中生北控生物科技有限公司，批號分別為E-53820、A127889、JKSJ--1564）；白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測試劑盒（欣博盛生物科技有限公司，批號分別為MM-0670R22、MM-0670R95）；谷胱甘肽（GSH）、髓過氧化物酶（MPO）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號分別為A005、E004-4-12）；蛋白抽提試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司，批號AR0103）；COX-2、Nrf2 和血紅素氧化酶-1（HO-1）抗體（美國Santa Cruz 公司，批號分別為sc-52159、sc-39345、sc-58684）；β-actin 抗體、辣根過氧化物酶HRP 標記親和純化山羊抗大鼠IgG 二抗（武漢艾美捷科技有限公司，批號分別為C1313、115-035-003）。

1.3 主要儀器 ASP300S 型組織脫水機、EG1150 型包埋機、Leica RM2255 型全自動輪轉切片機等病理配套設備（德國Leica 公司）；LV100ND 型顯微鏡（日本尼康公司）；AU2700 型全自動生化分析儀（日本Olympus 公司）；HBS-1096B 型酶標儀（南京德鐵實驗設備有限公司）；DYCZ-25D 型垂直電泳儀（上海熙浩實業(yè)有限公司）；JS-780 型凝膠成像儀（杭州得聚儀器設備有限公司）。

1.4 分組、造模及給藥 選60 只成年雄性SD 大鼠適應性喂養(yǎng)1 周后進行實驗。應用隨機數(shù)字表法均分為假手術組、模型組、山茱萸低、中、高劑量組和烏司他丁組，每組10 只。采用盲腸結扎穿孔術建立膿毒癥大鼠模型[5]，操作如下：對所有大鼠進行麻醉，作1cm 長的正中切口，暴露盲腸。模型組、山茱萸低、中、高劑量組和烏司他丁組大鼠將盲腸用3-0 絲結扎，21 號針穿刺2 次，輕輕擠壓出少量糞便，重新定位盲腸，然后用3-0 絲線將腹部逐層縫合關腹。假手術組大鼠也進行同樣的手術，但不結扎和穿刺。手術后，將大鼠放回籠子里，自由獲得水和食物。造模1h后，山茱萸低、中、高劑量組大鼠分別灌胃4、8、12g/kg 山茱萸提取物[6]，灌胃體積10mL/kg，同時尾靜脈注射2mL 生理鹽水；烏司他丁組大鼠灌胃10mL/kg生理鹽水同時尾靜脈注射烏司他丁10 萬U/kg[7]，注射體積2mL；假手術組和模型組大鼠分別灌胃（10mL/kg）和尾靜脈注射（2mL）生理鹽水，24h 后麻醉，心臟取血，處死大鼠進行相關檢測。

1.5 大鼠肝組織病理學觀察 取部分大鼠肝組織，用10%甲醛進行固定24h，經(jīng)脫水、包埋、切片（3μm），進行蘇木精-伊紅（HE）染色，用光學顯微鏡觀察組織病理學變化。

1.6 全自動生化分析儀檢測肝功能指標 將3mL血液以3000r/min 離心15min 分離血清，用全自動生化分析儀檢測血清ALT、AST 和BIL 水平。

1.7 ELISA 法檢測肝組織GSH、MPO、IL-6 和TNFα 表達水平 取大鼠肝組織，加入生理鹽水（1:10）制成勻漿，5000r/min 離心10min，收集上清液，按照試劑盒說明書檢測肝組織GSH、MPO、IL-6 和TNF-α水平。

1.8 蛋白免疫印跡法檢測肝組織COX-2、Nrf2 和HO-1 蛋白表達水平 取約100mg 大鼠肝組織研碎，根據(jù)組織重量加入相應蛋白抽提試劑，冰浴2h，離心后取上清，進行電泳，每孔上樣量為30μg，將印跡轉移到PVDF 膜上，然后用5%脫脂牛奶在室溫下封膜1h，加入COX-2（1:500）、Nrf2（1:500）和HO-1（1:800）和β-actin（1:1000）抗體，4℃孵育過夜，將二抗（1:5000）在室溫下孵育30min。用ECL 法進行顯色，采集圖像，用AlphaEaseFC 圖像分析進行分析。

1.9 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 23.0 軟件進行統(tǒng)計分析。實驗數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用SNK-q 檢驗，P＜0.05 差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠肝組織病理學比較 假手術組大鼠肝組織未見病理損害；模型組大鼠肝組織見大量炎性細胞浸潤，肝細胞水腫和壞死，肝索及肝竇消失；各山茱萸劑量組和烏司他丁組大鼠肝組織可見不同程度淤血、肝竇輕度擴張和炎性細胞浸潤，但其損傷程度明顯輕于模型組，且山茱萸高劑量組和烏司他丁組無明顯差異。見圖1。

2.2 各組大鼠血清ALT、AST 和BIL 水平比較 與假手術組比較，模型組大鼠血清ALT、AST 和BIL 水平增加（P均＜0.05）；與模型組比較，各山茱萸劑量組大鼠血清ALT、AST 和BIL 水平降低，呈劑量依賴性（P均＜0.05）；烏司他丁組和山茱萸高劑量組血清ALT、AST 和BIL 水平比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

2.3 各組大鼠肝組織GSH 和MPO 水平比較 與假手術組比較，模型組大鼠肝組織GSH 水平降低、MPO 水平增加（P均＜0.05）；與模型組比較，各山茱萸劑量組大鼠肝組織GSH 水平增加、MPO 水平降低，呈劑量依賴性（P均＜0.05）；山茱萸高劑量組GSH和MPO 水平與烏司他丁組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

2.4 各組大鼠肝組織IL-6 和TNF-α 水平比較 與假手術組比較，模型組大鼠肝組織IL-6 和TNF-α水平增加（P均＜0.05）；與模型組比較，各山茱萸劑量組大鼠肝組織IL-6 和TNF-α 水平降低，呈劑量依賴性（P均＜0.05）；山茱萸高劑量組IL-6 和TNF-α水平與烏司他丁組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表3。

表1 各組大鼠血清ALT、AST 和BIL 水平比較（）

表1 各組大鼠血清ALT、AST 和BIL 水平比較（）

注：假手術組、模型組灌胃（10mL/kg）和尾靜脈注射（2mL）生理鹽水；山茱萸低、中、高劑量組分別灌胃4、8、12g/kg 山茱萸提取物（灌胃體積10mL/kg），同時尾靜脈注射2mL 生理鹽水；烏司他丁組尾靜脈注射烏司他丁10 萬U/kg（注射體積2mL），同時灌胃10mL/kg 生理鹽水；ALT 為丙氨酸氨基轉移酶；AST 為天冬氨酸氨基轉移酶；BIL 為膽紅素；與假手術組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與山茱萸低劑量組比較，cP＜0.05；與山茱萸中劑量組比較，dP＜0.05

2.5 各組大鼠肝組織COX-2、Nrf2 和HO-1 蛋白表達水平比較 與假手術組比較，模型組大鼠肝組織COX-2 蛋白表達水平增加、Nrf2 和HO-1 蛋白水平降低（P均＜0.05）；與模型組比較，各山茱萸劑量組大鼠肝組織COX-2 蛋白水平降低、Nrf2 和HO-1蛋白水平增加，呈劑量依賴性（P均＜0.05）；山茱萸高劑量組COX-2、Nrf2 和HO-1 蛋白表達水平與烏司他丁組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表4和圖2。

圖1 各組大鼠肝組織病理學比較（HE×200）

表2 各組大鼠肝組織GSH 和MPO 水平比較（）

表2 各組大鼠肝組織GSH 和MPO 水平比較（）

注：假手術組、模型組灌胃（10mL/kg）和尾靜脈注射（2mL）生理鹽水；山茱萸低、中、高劑量組分別灌胃4、8、12g/kg 山茱萸提取物（灌胃體積10mL/kg），同時尾靜脈注射2mL 生理鹽水；烏司他丁組尾靜脈注射烏司他丁10 萬U/kg（注射體積2mL），同時灌胃10mL/kg 生理鹽水；GSH 為谷胱甘肽；MPO 為髓過氧化物酶；與假手術組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與山茱萸低劑量組比較，cP＜0.05；與山茱萸中劑量組比較，dP＜0.05

表3 各組大鼠肝組織IL-6 和TNF-α 水平比較（pg/mL，）

表3 各組大鼠肝組織IL-6 和TNF-α 水平比較（pg/mL，）

注：假手術組、模型組灌胃（10mL/kg）和尾靜脈注射（2mL）生理鹽水；山茱萸低、中、高劑量組分別灌胃4、8、12g/kg 山茱萸提取物（灌胃體積10mL/kg），同時尾靜脈注射2mL 生理鹽水；烏司他丁組尾靜脈注射烏司他丁10 萬U/kg（注射體積2mL），同時灌胃10mL/kg 生理鹽水；IL-6 為白細胞介素-6；TNF-α 為腫瘤壞死因子-α；與假手術組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與山茱萸低劑量組比較，cP＜0.05；與山茱萸中劑量組比較，dP＜0.05

3 討論

膿毒癥是肝損傷的早期事件。因此，治療膿毒癥可能為肝損傷的治療提供重要的輔助作用。烏司他丁是常用抗炎藥，但其具有一定的副作用[8]。山茱萸具有調(diào)節(jié)免疫、抗炎和抗氧化等作用，常用于保肝方面的治療[9]。

膿毒癥期間，促炎性細胞因子的過度釋放導致嚴重的組織損傷和肝損傷。這些細胞因子，特別是TNF-α 和IL-6，在膿毒癥誘導的肝損傷中起重要作用，且TNF-α 和IL-6 水平持續(xù)升高與預后較差有關[10]。血清AST 水平升高的同時引起肝氧化應激參數(shù)的變化。同樣，GSH 在防止細胞氧化損傷中也起著重要作用，GSH 水平降低表明氧化應激反應的紊亂。MPO 是嗜中性粒細胞中的一種蛋白質，參與膿毒癥患者的早期炎癥過程，其在化膿性疾病中的升高，導致肝功能障礙[11]。本研究結果顯示，山茱萸提取物能降低膿毒癥大鼠血清AST、ALT 和BIL 水平，進而降低氧化應激水平（GSH 水平降增加，MPO 水平降低），抑制炎癥因子的釋放（TNF-α 和IL-6 水平降低），發(fā)揮肝功能保護作用。病理結果顯示，模型組大鼠肝組織見大量炎性細胞浸潤，肝細胞水腫和壞死，肝索及肝竇消失；各山茱萸劑量組可見不同程度淤血、肝竇輕度擴張和炎性細胞浸潤，但其損傷程度明顯輕于模型組，也支持了上述推斷。

表4 各組大鼠肝組織COX-2、Nrf2 和HO-1 蛋白水平比較（）

表4 各組大鼠肝組織COX-2、Nrf2 和HO-1 蛋白水平比較（）

注：假手術組、模型組灌胃（10mL/kg）和尾靜脈注射（2mL）生理鹽水；山茱萸低、中、高劑量組分別灌胃4、8、12g/kg 山茱萸提取物（灌胃體積10mL/kg），同時尾靜脈注射2mL 生理鹽水；烏司他丁組尾靜脈注射烏司他丁10 萬U/kg（注射體積2mL），同時灌胃10mL/kg 生理鹽水；COX-2 為環(huán)氧化酶-2；Nrf2 為NF-E2 相關因子2；HO-1 為血紅素氧化酶-1；與假手術組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與山茱萸低劑量組比較，cP＜0.05；與山茱萸中劑量組比較，dP＜0.05

圖2 各組大鼠肝組織COX-2、Nrf2 和HO-1 蛋白表達

目前已知，膿毒癥的病理機制中涉及到COX-2和誘導型一氧化氮合酶（iNOS）這兩種酶[12]。COX-2是一種誘導酶，催化花生四烯酸轉化為炎癥性前列腺素，在膿毒癥中加重炎癥反應和損傷器官。已經(jīng)證明，膿毒癥的損傷通過COX-2 的誘導激活巨噬細胞產(chǎn)生前列腺素E2（PGE2）。此外，COX-2 的抑制或缺失可減少內(nèi)毒素誘導的PGE2，提高膿毒癥大鼠的存活率[13]。研究表明，COX-2 在急性肺損傷（ALI）的發(fā)展中起重要作用，COX-2 水平隨著ALI 嚴重程度的增加而增加，而COX-2 的抑制減弱ALI 在酸誘導ALI 小鼠模型中的作用[14]。Nrf2 是膿毒癥中各種促炎細胞因子表達的重要下游調(diào)節(jié)因子，通常以滅活的形式存在于細胞質中。當被炎癥刺激激活時，它易位至細胞核并啟動許多炎癥相關基因的表達，例如TNF-α，IL-6，COX-2 和iNOS[15]。在膿毒癥誘導的肝損傷患者的各種炎性細胞中已檢測到Nrf2 活化被抑制[16]。同時，HO-1 是Nrf2 激活調(diào)控的主要抗炎酶，內(nèi)源性HO-1 在多種應激刺激下廣泛表達并高度誘導，在宿主防御過度炎癥損傷中發(fā)揮重要作用。通過藥物或基因轉移上調(diào)HO-1，可在炎癥和免疫反應等多種情況下發(fā)揮治療作用[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，山茱萸提取物能降低肝組織COX-2 蛋白水平，同時增加Nrf2和HO-1 蛋白水平，從而發(fā)揮膿毒癥大鼠肝損傷的保護作用。

綜上所述，山茱萸提取物可能通過影響COX-2/Nrf2 信號通路，降低膿毒癥誘導的大鼠肝組織炎癥細胞因子水平，對抗氧化應激，保護膿毒癥引起的肝損傷。