王 維 郭 欣

金錢白花蛇來源于眼鏡蛇科動物銀環(huán)蛇（Bungarus multicinctus Blyth）的幼蛇干燥體，具有祛風(fēng)、通絡(luò)、止痙的功效，臨床用于治療風(fēng)濕頑痹，麻木拘攣，中風(fēng)口眼?斜，半身不遂，抽搐痙攣，破傷風(fēng)，麻風(fēng)等病癥[1]。其含有蛋白質(zhì)、脂肪、氨基酸、糖類，以及鈣、磷、鐵、鋅等20 多種元素[2]。藥理研究顯示，金錢白花蛇具有良好的抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤作用[3]。目前，蛋白質(zhì)常用化學(xué)測定手段主要有微量凱氏定氮法[4]，雙縮脲試劑反應(yīng)[5]，F(xiàn)olin-酚法（Lowry）[6]等。Folin-酚試劑是蛋白質(zhì)含量測定最靈敏的方法之一，其原理是在堿性條件下，蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅離子結(jié)合生成復(fù)合物，F(xiàn)olin-酚試劑中的磷鉬酸鹽-磷鎢酸鹽被蛋白質(zhì)中的酪氨酸和色氨酸殘基還原，產(chǎn)生深藍(lán)色（鉬蘭和鎢蘭的混合物），藍(lán)色深度與蛋白的量成正相關(guān)[7]。此法操作簡單迅速不需特殊的儀器設(shè)備，且靈敏度高，15min 就有最大的顯色并可穩(wěn)定數(shù)小時(shí)。因此，本研究采用Folin-酚試劑法測定金錢白花蛇粉末中蛋白質(zhì)含量，以期為金錢白花蛇粉末中蛋白質(zhì)提取、分離、藥理活性等方面的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器 UV-2600 紫外分光光度計(jì)（島津公司）、HWS26-電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、電子分析天平（瑞士梅特勒）。

1.2 試劑 牛血清白蛋白（中國食品藥品檢定研究院，供含量測定用，批號20190327）、氫氧化鈉（天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司，批號970522）、鎢酸鈉（京華化工廠，批號970512）、鉬酸鈉（北京化學(xué)試劑公司，批號950912）、無水碳酸鈉（北京化工廠，批號20150728）、蒸餾水（MILL-Q 純水儀制備），其他試劑均為分析純，購于北京化工廠。二甲基亞砜（DMSO，購自Solarbio）。

1.3 試驗(yàn)樣品 不同批次的蘄蛇樣品購買自浙江省金華市磐安藥材城。分別編號標(biāo)記為樣品1（批號20190705），樣品 2（SZ -20180213），樣品 3（20190804），樣品4（20180925）。經(jīng)鑒定為眼鏡蛇科動物銀環(huán)蛇（Bungarus multicinctus Blyth）的幼蛇干燥體。不同批次樣品分別粉碎成細(xì)粉，過篩，混合均勻，備用。

2 方法

2.1 溶液制備

2.1.1 配制Folin-酚試劑A 所需溶液制備 0.8%氫氧化鈉溶液制備：精密稱取氫氧化鈉0.8g 于100mL量瓶中，加水溶解并定容至刻度，搖勻，得0.8%氫氧化鈉溶液。4%無水碳酸鈉溶液的制備：精密稱取無水碳酸鈉4.0g 于100mL 量瓶中，加水溶解并定容至刻度，搖勻，得4%氫氧化鈉溶液。2%酒石酸鉀鈉（KNaC4H4O6·4H2O）溶液的制備：精密稱取酒石酸鉀鈉2.0g 于100mL 量瓶中，加水溶解并定容至刻度，搖勻，得2%酒石酸鉀鈉溶液。1%硫酸銅（CuSO4）溶液的制備：精密稱取無水硫酸銅1g 于100mL 量瓶中，加水溶解并定容至刻度，搖勻，得1%硫酸銅溶液。

2.1.2 Folin-酚試劑A（1）4%無水碳酸鈉溶液25mL，0.8%氫氧化鈉溶液25mL，等體積混合。（2）2%酒石酸鉀鈉溶液0.5mL，1%硫酸銅溶液0.5mL，等體積混合。臨用時(shí)，將（1）與（2）按體積比50:1 比例混合均勻，即得。

2.1.3 Folin-酚試劑B 將鎢酸鈉（H4Na2O6W）100g，鉬酸鈉（Na2MoO4.2H2O）25g，水700mL，85%磷酸50mL，濃鹽酸100mL，置1500mL 磨口圓底燒瓶中，充分溶解，混勻，裝上磨口冷凝管，回流10h。然后，分別加入硫酸鋰150g，水50mL 及溴液數(shù)滴，開口煮15min，去除過量的溴，冷卻后稀釋至1000mL，濾過（呈微綠色）貯于棕色瓶中，臨用前用氫氧化鈉滴定液（1mol/L）滴定，酚酞作指示劑（由于試劑量微綠色，影響滴定終點(diǎn)觀察，可將試液稀釋100 倍再滴定），根據(jù)滴定結(jié)果，用水將試劑稀釋到相當(dāng)于1mol/L 的酸度（稀釋1 倍左右）。

2.1.4 對照品溶液制備 取牛血清白蛋白對照品約21.4mg，精密稱定，置25mL 容量瓶中，加0.1mol/L 的氫氧化鈉溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為0.856mg/mL 牛血清白蛋白儲備液。精密吸取3mL，置于25mL 容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為0.103mg/mL 對照品溶液。

2.1.5 供試品溶液的制備 稱取金錢白花蛇粉末約0.5g，置于100mL 量瓶中，加水適量使溶解，再加水定容至刻度，搖勻，精密吸取5mL，置于50mL 容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，即得。

2.2 Folin-酚試劑法 精密吸取系列牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，供試品溶液（0.9mL）加水至1.6mL，選取純凈水（3.2mL）作為隨行空白。分別置于具塞試管中，精密加入Folin-酚試劑A 4.0mL（空白加入8.0mL），搖勻，室溫放置10min，再分別精密加入Folin-酚試劑B 0.4mL（空白加入0.8mL），搖勻，密塞，在30℃水浴中保溫30min，恢復(fù)至室溫，采用紫外分光光度計(jì)在660nm 波長下測定吸光度。

2.3 MTT 法測定肝癌細(xì)胞抑制率 肝癌SMMC7721細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)后，以1.5×104/孔接種于96 孔板上，培養(yǎng)24h 到細(xì)胞貼壁后，將金錢白花蛇蛋白類提取物質(zhì)稀釋至終濃度為15mg/L（低劑量組）、30mg/L（中劑量組）、45mg/L（高劑量組）培養(yǎng)24h，對照組給予生理鹽水30mg/L，在每個(gè)孔中加入MTT 各20μL 繼續(xù)培養(yǎng)4h，停止培養(yǎng)后將培養(yǎng)基除去，每孔加入DMSO150μL，混合均勻，放置室溫下10min。以酶標(biāo)儀于490nm 測定光密度值（OD 值），細(xì)胞抑制率=（1-實(shí)驗(yàn)組OD 值/對照組OD 值）×100%。

3 方法學(xué)驗(yàn)證

3.1 線性關(guān)系 分別準(zhǔn)確吸取2.1.4 項(xiàng)下牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)儲備液0.0、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 和1.6mL，置于具塞試管中，各管加水至1.6mL，再分別精密加Folin-酚試劑A 4.0mL，搖勻，室溫放置10min，再分別精密加入Folin-酚試劑B 0.4mL，搖勻，密塞，在30℃水浴中保溫30min，放冷，在660nm 波長處測定吸光度，以蛋白質(zhì)含量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見圖1。

圖1 牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.2 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取對照品溶液2mL，重復(fù)測定吸光度6 次，RSD 為0.012%，表明儀器精密度良好。見表1。

3.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取供試品溶液（樣品2）2mL，分別放置0、1、1.5、2、2.5、3h 測定吸光度，供試品溶液在0～3h 內(nèi)穩(wěn)定性良好，RSD 值為1.550%。見表2。

3.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 分別稱取金錢白花蛇粉末6 份，每份各取約0.5g，置于100mL 量瓶中，加水適量使溶解，再加水定容至刻度，搖勻，精密吸取5mL，置于50mL 容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，6 份樣品RSD 為0.709%，表明實(shí)驗(yàn)重復(fù)性良好。見表3。

表1 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2 樣品穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表4 加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.5 加樣回收試驗(yàn) 分別稱取金錢白花蛇粉末6份，每份各約0.5g，分別向其中加入77.20mg 牛血清白蛋白對照品，置于100mL 量瓶中，加水適量使溶解，再加水定容至刻度，搖勻，精密吸取5mL，置于50mL 容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，精密吸取供試品溶液0.7mL，加水至1.6mL，分別置于具塞試管中，精密加入Folin-酚試劑A 4.0mL，搖勻，室溫放置10min，再分別精密加入Folin-酚試劑B 0.4mL，搖勻，密塞，在30℃水浴中保溫30min，恢復(fù)至室溫，采用紫外分光光度計(jì)在660nm 波長下測定吸光度，計(jì)算蛋白質(zhì)含量，結(jié)果顯示，蛋白質(zhì)平均回收率為99.477%，RSD=0.873%。見表4。

3.6 樣品含量測定 分別準(zhǔn)確稱量樣品各約0.5g，按照上述樣品測定方法進(jìn)行制備并測定蛋白質(zhì)含量。各樣品蛋白質(zhì)含量由高到低依次為樣品2（173.380mg/g）、樣品4（170.810mg/g）、樣品1（153.390mg/g）、樣品3（126.470mg/g）。見表5。

3.7 對肝癌SMMU7721 細(xì)胞增殖的影響 與對照組相比較，白花蛇蛋白各個(gè)劑量組肝癌SMMU7721細(xì)胞增殖抑制率均大于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。其抑制率隨著濃度升高而逐漸增加，高劑量組抑制率達(dá)到67.821%。表明金錢白花蛇蛋白類物質(zhì)對肝癌細(xì)胞有顯著抑制作用。見表6。

表5 金錢白花蛇粉末中蛋白質(zhì)含量測定結(jié)果（mg/g）

表6 MTT 法檢測白花蛇蛋白對肝癌細(xì)胞增殖抑制率比較

4 討論

本研究采用Folin-酚試劑法測定金錢白花蛇粉末中蛋白質(zhì)含量。已有研究利用Folin-酚試劑法測定蛋白質(zhì)總量，并證實(shí)該方法可靠、準(zhǔn)確度高，且操作簡便[8-10]。石森林和王黎霞[11]很早就采用Folin-酚試劑法測定蘄蛇中蛇毒的蛋白含量，該方法回收率能達(dá)到98.00%以上，RSD 為1.76%，且簡便、穩(wěn)定、重現(xiàn)性好。研究顯示，蛇類所含的蛋白質(zhì)成分有抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡作用[12]。通過調(diào)節(jié)P53 和P21 蛋白表達(dá)起到抗腫瘤作用等[13]。

本研究結(jié)果顯示，已建立的蛋白質(zhì)含量測定方法具有操作簡便，靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確可靠等特點(diǎn)，適用于中藥金錢白花蛇中蛋白質(zhì)含量的測定。金錢白花蛇作為傳統(tǒng)的中藥，以鮮藥組方入藥用于原發(fā)性肝癌的治療，但是其抗腫瘤機(jī)制尚不清楚。本研究結(jié)合所建立方法為金錢白花蛇蛋白質(zhì)的質(zhì)量控制、藥效評價(jià)、藥理活性篩查等后續(xù)深入研究奠定了基礎(chǔ)。同時(shí)本研究初步研究了金錢白花蛇蛋白類提取物質(zhì)對肝癌SMMU7721 細(xì)胞增殖抑制的作用。結(jié)果顯示，隨著蛋白給藥劑量增加，其抑制率逐漸增強(qiáng)，提示金錢白花蛇蛋白類活性物質(zhì)可能與其抗腫瘤存在一定的關(guān)系。