游豐鋒 楊光勇 涂小華 何亞敏 喻良錦 李雨彤 李 燦 田維毅 何光志

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）多累及遠端結(jié)腸，亦可遍及全部結(jié)腸[1]。腸黏膜屏障損傷及由此造成的腸壁通透性增高是UC 發(fā)病的始動因素和病情進展的核心環(huán)節(jié)[2]，腸道微生物群—宿主之間的相互作用被破壞等因素與UC 發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3-5]。腸道益生菌是組成腸道黏膜屏障的重要部分，而腸道菌群失調(diào)與免疫功能異常則直接影響UC 的演變[6]。丙酸為嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphila，A.muciniphila）代謝產(chǎn)物之一，具有免疫調(diào)節(jié)作用，并能將黏蛋白進行分解和再促合成，從而維持腸道黏膜屏障穩(wěn)定。本研究通過腸桿菌基因間重復(fù)共有序列（ERIC）-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）和半定量PCR 技術(shù)分析保和丸對UC 模型小鼠腸道菌群多樣性和A.muciniphila 菌的含量變化，并通過觀察腸道組織病理切片從形態(tài)學(xué)改變分析腸黏膜屏障損傷和炎癥預(yù)后及轉(zhuǎn)歸。

1 實驗材料

1.1 動物 SPF 級6 周齡KM 小鼠40 只，雌雄各半，體質(zhì)量（20±2）g，購自長沙市天勤生物技術(shù)有限公司，動物使用許可證號：SCXK（湘）2019-0014。小鼠以小組單籠喂養(yǎng)，自由進食和飲水，環(huán)境：濕度60%、溫度25°C、12h/12h 的光照/黑暗周期。所有實驗操作符合3R 原則（減少、替代、優(yōu)化）給予人道關(guān)懷。本研究通過貴州中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會審核。

1.2 試劑與藥品 右旋葡聚糖硫酸鈉（dextran sulphate sodium，DSS，Sigma-Aldrich 公司，批號H02J9 B62777）；保和丸（北京同仁堂，批號18081639）；美沙拉嗪（莎爾福公司，注冊證號H20171358，批號17G27518L）；糞便基因組DNA 提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司，批號S8114]；快捷型瓊脂糖DNA 回收試劑盒Ⅱ型（北京百泰克生物公司，批號20170214）；2×Taq PCR MasterMix（批號R6801）。

2 實驗方法

2.1 藥物制備及給藥 參考徐叔云教授主編的《藥理實驗方法學(xué)》[7]，按體表面積計算劑量，配制成濃度為6.5mg/mL 的美沙拉嗪藥液，按0.1mL/10g 鼠重給藥體積灌胃給藥，每次0.2mL，1 天3 次；制備保和丸水溶劑，配制成濃度為78mg/mL 藥液，按0.1mL/10g鼠重灌胃給藥體積，每次0.2mL，1 天2 次。取0.3g DSS 溶于少量蒸餾水后再稀釋至10mL，即為3%DSS 溶液。

2.2 分組及UC 模型制備 40 只小鼠按隨機數(shù)字表法分為空白對照組、模型組、美沙拉嗪組（0.065g/kg，3 次/天）和保和丸組（0.78g/kg，2 次/天），每組10 只?？瞻讓φ战M給予蒸餾水，參考文獻[8-10]誘發(fā)小鼠UC 模型方法，用DSS 誘導(dǎo)制備UC 小鼠模型，除空白對照組外，其余各組采用灌胃3% DSS 溶液連續(xù)7天，誘導(dǎo)UC 模型，第8 天開始全部換成蒸餾水。造模成功后第1 天開始灌胃給藥，空白對照組與模型組給予等體積的蒸餾水，其余各組按上述劑量給予相應(yīng)的藥物，連續(xù)給藥7 天。

2.3 小鼠疾病活動指數(shù)（disease activity index，DAI）評分 自造模之日起，每天觀察并記錄小鼠精神狀態(tài)、進食、飲水和活動度等一般情況，定時稱量小鼠體質(zhì)量，觀察糞便情況及便血狀態(tài)，參照文獻[11]進行DAI 評分。評分依據(jù)為黏著在肛門的水樣便為稀便，不黏著于肛門的糊狀大便為半稀便，成型的糞便為正常便。計算方法為DAI=（體質(zhì)量+大便性狀分?jǐn)?shù)+隱血分?jǐn)?shù)）/3。

2.4 引物設(shè)計與合成 根據(jù)前期研究[12]，設(shè)計引物序列：ERIC-1：5'-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3'，ERIC-2：5'-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3'；根據(jù)秦倩倩等[13]報道，合成A.muciniphila 細菌基因特異性引物，上游引物：5'-CAGCACGTGAAGGTGGGGAC-3'，下游引物：5'-CCTTGCGGTTGGCTTCAGAT-3'，基因全長：329bp；由上海生工生物工程有限公司合成。

2.5 各組糞便樣品基因組模板制備 DNA 實驗第18 天，收集小鼠新鮮糞便樣本，按糞便基因組DNA試劑盒說明書嚴(yán)格進行操作，提取基因組DNA，用核酸濃度檢測儀測定提取的DNA 模板的純度及濃度，確保DNA 純度A260/A280nm 比值在1.6～1.8，濃度在200ng/μL 左右，均置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.6 ERIC-PCR 反應(yīng)體系為：DNA 模板2μL，10μmol/L 上、下游引物各0.5μL，2×Taq PCR Master-Mix[0.1U Taq Polymerase/μL，500μmol dNTP each，20mmol Tris-HCl（pH 值為8.3），100mmol KCl，3mmol MgCl2]12.5μL，ddH2O 補足至25μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性7min；95℃變性30s，46℃退火90s，72℃延伸3min，共35 個循環(huán)；72℃延伸5min。

2.7 A.muciniphila 菌半定量PCR 反應(yīng)體系 反應(yīng)采用20μL 體系：模板2μL，10μmoL/L 上下游引物各0.3μL，2×Taq PCR MasterMix 10μL，去離子水補充體系至20μL。PCR 反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10min；95℃變性30s，60℃退火40s，72℃延伸30s，39 個循環(huán)，65℃延伸10min。

2.8 條帶克隆測序與序列分析 選取A.muciniphila菌半定量PCR 產(chǎn)物目的條帶，按瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒說明書回收DNA。收集菌體送上海生工生物有限公司測序，將測序結(jié)果與GenBank 中已登錄的細菌DNA 序列用BLAST 軟件進行比對分析。

2.9 結(jié)腸組織病理學(xué)檢測 實驗第18 天摘取結(jié)腸組織，挑選有潰瘍的結(jié)腸組織置于10%甲醛溶液中放置24h 以上，將組織修正大小為1.0cm×1.0cm×0.2cm，放入包埋盒沖洗12h，瀝干水后，分別置于100、95、90、85、80、70%乙醇1h；二甲苯1、二甲苯2，各30min；置于左右蠟缸各1h，冰凍后置于切片機，組織切到5μm 厚，進行展片、鋪片，將裝有結(jié)腸組織的載玻片放入烘干箱12h，按照切片盒步驟依次對結(jié)腸組織進行HE 染色，觀察切片結(jié)果。

2.10 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用單因素方差分析比較，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 各組小鼠DAI 評分比較 造模成功后模型組、美沙拉嗪組及保和丸組小鼠均出現(xiàn)精神呆滯、行動緩慢、便血、體質(zhì)量下降，而空白對照組小鼠精神、活動度、飲食、毛發(fā)、大便、體質(zhì)量等一般情況均為正常。藥物干預(yù)前，各實驗組小鼠DAI 評分顯著高于空白對照組（P均＜0.01）；藥物干預(yù)后，美沙拉嗪組及保和丸組小鼠DAI 評分顯著低于本組干預(yù)前（P均＜0.01）和同期模型組（P＜0.05），美沙拉嗪組與保和丸組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

3.2 ERIC-PCR 檢測腸道菌群的多樣性 與空白對照組比較，模型組條帶數(shù)量未明顯減少，說明腸道菌群的多樣性無明顯變化，但條帶位置變化較明顯，說明菌群紊亂，腸道菌群豐度減少。保和丸組與美沙拉嗪組條帶數(shù)量明顯減少，提示菌群基因組DNA 含量明顯減少，腸道菌群多樣性抑制。見圖1。

3.3 半定量PCR 檢測A.muciniphila 菌 與空白對照組比較，模型組條帶稍明顯，提示A.muciniphila 菌群豐度有所升高，美沙拉嗪組稍暗，提示菌群豐度有所降低，保和丸組亮度明顯升高，提示菌群豐度明顯升高。見圖2。

表1 各組小鼠DAI 評分比較（分，）

表1 各組小鼠DAI 評分比較（分，）

注：空白對照組為正常小鼠給予生理鹽水；模型組為UC 模型小鼠給予生理鹽水；美沙拉嗪組為UC 模型小鼠給予0.065mg/kg，3 次/天美沙拉嗪混懸液；保和丸組為UC 模型小鼠給予0.78mg/kg，2 次/天保和丸混懸液；DAI 為疾病活動指數(shù)；UC 為潰瘍性結(jié)腸炎；與空白對照組同期比較，aP＜0.01；與本組干預(yù)前比較，bP＜0.01，與模型組同期比較，cP＜0.05；與本組干預(yù)后3 天比較，dP＜0.01

圖1 ERIC-PCR 擴增結(jié)果

圖2 A.muciniphila 菌半定量PCR 結(jié)果

3.4 條帶克隆測序與序列分析 克隆測序結(jié)果顯示，與GenBank 中已登錄的細菌DNA 序列（NR_042817.1）用BLAST 軟件進行比對分析結(jié)果一致，屬于Akkermansia muciniphila ATCC BAA-835 strain Muc 16S ribosomal RNA，partial sequence，基因全長329bp。見圖3。

圖3 目的基因片段測序核酸堿基序列

3.5 各組小鼠結(jié)腸組織病理改變 空白對照組小鼠結(jié)腸組織基本未見炎性細胞浸潤的現(xiàn)象，黏膜層肌層完好，未見潰瘍形成，隱窩和腺體等組織結(jié)構(gòu)完整，排列規(guī)則（見圖4A）；模型組小鼠病理組織切片顯示，膜層肌層變薄，見明顯潰瘍形成，組織結(jié)構(gòu)被破壞，大量炎性細胞浸潤（見圖4B）；與模型組比較，藥物干預(yù)后，美沙拉嗪組（見圖4C）和保和丸組（見圖4D）小鼠結(jié)腸組織黏膜損傷恢復(fù)較好，炎性細胞數(shù)量和浸潤深度減少。

圖4 各組小鼠結(jié)腸組織病理改變（HE ×200）

4 討論

研究顯示，用3% DSS 溶液灌胃造模的小鼠腸道內(nèi)優(yōu)勢菌屬減少，而大腸桿菌、腸球菌和小梭菌菌群等條件致病菌數(shù)量顯著增加[14]，即UC 小鼠腸道菌群正常結(jié)構(gòu)失衡，導(dǎo)致機體腸道的炎癥產(chǎn)生。本研究小鼠DAI 評分結(jié)果顯示，用3% DSS 溶液給小鼠連續(xù)灌胃7 天可以有效的導(dǎo)致UC 的產(chǎn)生。美沙拉嗪組及保和丸組在治療3、7 天后均有所改善且小鼠各項身體指標(biāo)恢復(fù)情況相似，模型組雖未治療，但小鼠也有一定的自愈。造模后的小鼠與空白對照組相比，腸道菌群分布及多樣性都有明顯改變，每只小鼠個體略有差異但每組總體變化相同，其中服用保和丸與服用美沙拉嗪對腸道菌群結(jié)構(gòu)多樣性均可產(chǎn)生一定的影響。

A.muciniphila 菌在腸道的外黏液層中定植，其分解黏蛋白并刺激杯狀細胞合成黏蛋白達到動態(tài)平衡，從而維持黏液層的穩(wěn)定[13]。相關(guān)研究表明，在治療難治性慢性活動性UC 時，含有高豐富度的A.muciniphila 糞便樣本似乎有利于進行糞便菌群移植療法[15]。本研究克隆測序結(jié)果顯示，目的基因檢測正確，結(jié)合半定量PCR 結(jié)果可以看出，保和丸組A.muciniphila 菌群豐度明顯升高，提示保和丸對DSS誘導(dǎo)的UC 模型小鼠腸道A.muciniphila 菌有明顯促進增殖的作用。

藥理研究表明，保和丸主要有助消化、調(diào)節(jié)腸胃功能、抗?jié)兒鸵志淖饔肹16]，能促進雙歧桿菌目菌群數(shù)量[17]，還可促進梭菌目、脫硫弧菌目、產(chǎn)氫細菌目菌群數(shù)量，同時減少紅蝽菌目、擬桿菌目、芽孢肝菌目、乳桿菌目、丹毒絲菌目、伯克氏菌目、氣單胞菌目、疣微菌目菌群數(shù)量[18]。說明保和丸有一定選擇性抑菌作用，但其對UC 菌群紊亂的調(diào)節(jié)作用機制尚不明確。

腸道菌群參與固有免疫和適應(yīng)性免疫，黏膜上皮組織的屏障作用是黏膜局部固有免疫的重要機制，如腸上皮細胞損傷可致使腸道內(nèi)大量抗原與腸道免疫細胞接觸并使之激活，產(chǎn)生大量炎性因子，造成腸道組織損傷[19]。從本研究各組小鼠結(jié)腸組織病理改變可以看出，除空白對照組外，其他組小鼠結(jié)腸組織都有潰瘍，且腸黏膜損傷程度不同。與模型組相比，保和丸組與美沙拉嗪組小鼠結(jié)腸黏膜損傷恢復(fù)較好，炎性細胞數(shù)量和浸潤深度減少。提示保和丸與美沙拉嗪能修復(fù)DSS 誘導(dǎo)的腸道黏膜損傷，控制炎癥的發(fā)生發(fā)展，保護腸道?？傊?，本研究結(jié)果顯示，保和丸具有一定的促進腸黏膜屏障損傷修復(fù)的作用。