陳瑩嫻，馬月姣，李建成

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 100193)

抗球蟲(chóng)藥物常作為飼料添加劑使用，飼料污染的情況時(shí)有發(fā)生[6]。這可能會(huì)對(duì)非目標(biāo)動(dòng)物造成毒性作用，并可能導(dǎo)致食物中含有藥物殘留，在食用抗球蟲(chóng)藥物殘留的食品后，雖然未觀察到對(duì)人體產(chǎn)生急性毒性，但長(zhǎng)期暴露于低濃度水平的藥物殘留，人體內(nèi)可能發(fā)生慢性毒性作用[7-8]。因此，許多國(guó)家對(duì)動(dòng)物使用該類藥物以及在動(dòng)物源食品中的殘留情況進(jìn)行了嚴(yán)格監(jiān)控。包括中國(guó)(表1)和歐盟[7]在內(nèi)多個(gè)國(guó)家或組織制定了相關(guān)法規(guī)，規(guī)定雞組織中抗球蟲(chóng)藥物的最高殘留限量(MRLs)。

目前，對(duì)抗球蟲(chóng)藥物的檢測(cè)方法主要有色譜(串聯(lián)質(zhì)譜)檢測(cè)法[9-12]，以及免疫分析檢測(cè)法。免疫檢測(cè)法是基于抗原-抗體相結(jié)合的原理，采用不同的信號(hào)放大系統(tǒng)對(duì)待測(cè)物進(jìn)行定性和定量?？贵w的制備是決定檢測(cè)技術(shù)靈敏度的關(guān)鍵因素。免疫分析方法具有開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)便、成本低、操作簡(jiǎn)單、能夠快速檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)高通量快速篩選，在畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)中廣泛應(yīng)用[13-14]。但其無(wú)法達(dá)到對(duì)多種殘留藥物的同時(shí)定量檢測(cè)。一個(gè)成功的免疫檢測(cè)法必須要具備3個(gè)要素：性能優(yōu)良的抗體、靈敏且專一的標(biāo)記物和高效的分離手段。傳統(tǒng)的單克隆抗體制備過(guò)程繁瑣，成為免疫分析方法的限制因素之一。

1 酶聯(lián)免疫吸附分析方法

酶聯(lián)免疫吸附分析(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)是將抗原或抗體結(jié)合到固相載體表面，加入待檢測(cè)的樣品溶液以及某種酶標(biāo)記的抗體或抗原，使其與固相載體上的抗體或抗原反應(yīng)。再通過(guò)洗滌去除抗原-抗體復(fù)合物以外的物質(zhì)。加入酶反應(yīng)底物顯色，結(jié)合在固相載體上的酶量與樣品中待測(cè)物的量成一定比例[15-17]。該方法可用于診斷疾病和檢測(cè)小分子化合物[18]。其原理如圖1A所示。Tian等[19]描述了一種基于免疫磁珠(IMB)凈化的間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附法(icELISA)，檢測(cè)雞肉和雞肝中鹽霉素的殘留。將單克隆抗體固定在羧化微球(直徑2.8 μm)的表面上，樣品經(jīng)簡(jiǎn)單提取后，待測(cè)物被抗體特異性吸附，通過(guò)磁分離去除上清，保留在磁珠上的待測(cè)物隨后被洗脫釋放。與傳統(tǒng)的親水親脂平衡柱(HLB柱)凈化的icELISA方法相比，該方法的抑制率和靈敏度都有所提高，并且磁珠可重復(fù)使用。Li等[20]描述了基于單克隆抗體的icELISA方法，檢測(cè)可食用雞組織(肌肉、腎、肝、皮膚和脂肪)中的莫能菌素殘留。該方法與高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS)相比，樣品檢測(cè)結(jié)果成正相關(guān)。這些結(jié)果表明，作者制備的單克隆抗體和開(kāi)發(fā)的檢測(cè)方法是檢測(cè)雞組織中馬杜霉素的有用工具。Li等[21]制備了乙氧酰胺苯甲酯的單克隆抗體，建立icELISA方法檢測(cè)雞肌肉和肝中藥物殘留，該方法的IC50為0.66 ng·mL-1，對(duì)已發(fā)表的方法提供了一種節(jié)省成本的替代方法。Zhang等[22]使用新型抗體開(kāi)發(fā)一步式icELISA法，可快速、特異性地檢測(cè)動(dòng)物源食品中地克珠利殘留。Song等[23]建立了基于磁珠凈化的icELISA檢測(cè)方法，檢測(cè)雞組織中馬杜霉素的殘留量，并對(duì)磁珠的性能進(jìn)行了評(píng)估。結(jié)果表明，免疫磁珠可以快速、穩(wěn)定地凈化樣品，并且基于免疫磁珠的ELISA檢測(cè)方法更簡(jiǎn)便、省時(shí)且環(huán)保，可廣泛應(yīng)用于雞組織中馬杜霉素的殘留檢測(cè)。ELISA在檢測(cè)抗球蟲(chóng)藥物殘留的應(yīng)用見(jiàn)表2。

2 免疫層析法

免疫層析法(immunochromatography, ICA)是一種快速有效的檢測(cè)方法，該方法大大縮短了整個(gè)分析時(shí)間,已應(yīng)用于多個(gè)檢測(cè)領(lǐng)域，可在非實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下操作[24]。與其他較復(fù)雜的分析方法相比，該方法的靈敏度較低[25]。免疫層析分析方法結(jié)合了特異性抗體、膠體顆粒(金、乳膠、碳等)和層析膜(硝化纖維素膜)。其原理如圖1B所示，采用免疫標(biāo)記技術(shù)將膠體顆粒直接或間接地與特異性抗體結(jié)合，標(biāo)記抗體涂抹在層析膜上，層析膜一端浸潤(rùn)樣品溶液，通過(guò)層析作用與抗體特異性結(jié)合。測(cè)試結(jié)果可根據(jù)T線(test line)和C線(control line)的顯色程度在幾分鐘內(nèi)通過(guò)目測(cè)或儀器測(cè)量確定[26]。

表1 中國(guó)規(guī)定可食用動(dòng)物組織中抗球蟲(chóng)藥的MRLs

表2 ELISA法檢測(cè)抗球蟲(chóng)藥物殘留的應(yīng)用

最常見(jiàn)的方法是將單克隆抗體與膠體金(colloidal gold, CG)偶聯(lián)制備免疫層析試紙條，檢測(cè)樣品溶液中藥物的殘留[27-34]。膠體金具有制備穩(wěn)定、摩爾消光系數(shù)高、顏色明顯的特點(diǎn)[35-36]。膠體金免疫層析試紙條制備簡(jiǎn)便，使用方便，不需配備昂貴的設(shè)備和專業(yè)的技術(shù)人員，因此，能夠在畜牧養(yǎng)殖場(chǎng)中廣泛應(yīng)用。Fitzgerald等[37]建立了多殘留檢測(cè)的測(cè)流免疫分析方法，通過(guò)化學(xué)偶聯(lián)法在特異性抗體上連接有色的羧化微球，可同時(shí)檢測(cè)雞蛋中常山酮、妥曲珠利和地克珠利3種藥物的殘留。采用像素分析的方式，通過(guò)測(cè)量檢測(cè)區(qū)域帶的像素強(qiáng)度，將該方法從一步定性轉(zhuǎn)變?yōu)榭闪炕治?，?jiǎn)單且經(jīng)濟(jì)高效，為將來(lái)更有效地同時(shí)監(jiān)測(cè)小分子藥物鋪平了道路。免疫層析法在檢測(cè)抗球蟲(chóng)藥物殘留的應(yīng)用見(jiàn)表3。

表3 免疫層析法檢測(cè)抗球蟲(chóng)藥物殘留的應(yīng)用

3 熒光偏振免疫分析法和時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定法

熒光偏振免疫分析法(fluorescence polarization immunoassay，F(xiàn)PIA)原理(圖1C)是熒光標(biāo)記抗原與特異性抗體結(jié)合形成大分子復(fù)合物后，使熒光素的熒光偏振信號(hào)強(qiáng)度增強(qiáng)，當(dāng)目標(biāo)待測(cè)物存在時(shí)，待測(cè)物與抗原競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合特異性抗體，使熒光偏振值減小[38-39]。此反應(yīng)是均相反應(yīng)，減少了多次洗滌的步驟和反應(yīng)時(shí)間，并且不受溶液顏色和儀器靈敏度變化的影響[40]。該方法常用來(lái)檢測(cè)小分子化合物在樣品中的含量[41]，并且可用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)[42]。

Wang等[43]建立并優(yōu)化了用特異性多克隆抗血清檢測(cè)雞組織(脂肪和肌肉)和雞蛋中馬度米星的熒光偏振免疫分析法(FPIA)。采用N-羥基琥珀酰亞胺活性酯法合成熒光標(biāo)記物來(lái)標(biāo)記馬度米星(示蹤劑)，并用薄層色譜法(TLC)純化。該方法的IC50值比最敏感的ELISA方法低4倍。同一團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)并優(yōu)化了測(cè)定緩沖液中鹽霉素的FPIA，表明所用的抗鹽霉素單克隆抗體與其他藥物無(wú)明顯交叉反應(yīng)，與甲基鹽霉素的交叉反應(yīng)率為67.6%，并預(yù)測(cè)該分析方法可用于食品樣品篩選，但還未證實(shí)[44]。

時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定法(time-resolved fluoroimmunoassay, TrFIA)是利用鑭系絡(luò)合物,如銪(Eu)、鋱(Tb)、釤(Sm)和鏑(Dy)的三價(jià)稀土離子及其螯合物作為標(biāo)記物的免疫分析技術(shù)[45]，鑭系絡(luò)合物很穩(wěn)定，具有熒光壽命長(zhǎng)、stokes位移大、馳豫時(shí)間長(zhǎng)且能夠克服背景吸收的優(yōu)勢(shì)[46]。TrFIA旨在降低非特異性背景熒光的干擾，解決放射性同位素使用時(shí)的問(wèn)題,使設(shè)計(jì)超靈敏的生物分析方法成為可能性[46-48]，具有安全、費(fèi)用低、操作簡(jiǎn)便、可實(shí)現(xiàn)床旁快速檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)[49-50]。

Peippo等[51]建立了快速TrFIA檢測(cè)法，用于篩選家禽肌肉和雞蛋樣品中是否存在甲基鹽霉素和鹽霉素，由于甲基鹽霉素與鹽霉素具有100%的交叉反應(yīng)，所以Peippo等僅評(píng)估了甲基鹽霉素的檢測(cè)性能。此方法的一個(gè)缺點(diǎn)是需要對(duì)肌肉樣品使用SPE柱進(jìn)行額外的固相萃取的純化步驟。以此為基礎(chǔ)，Peippo等[52]對(duì)前處理方法進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，建立了家禽血液和肌肉中甲基鹽霉素的TrFIA檢測(cè)法以及進(jìn)行血液中的動(dòng)力學(xué)研究。Hagren等[53]將時(shí)間分辨熒光測(cè)定法與新型的一體化干燥化學(xué)概念相結(jié)合來(lái)進(jìn)行進(jìn)一步創(chuàng)新，檢測(cè)雞肝和雞蛋中尼卡巴嗪的殘留量。將抗尼卡巴嗪的特異性抗體固定在單個(gè)微量滴定孔中，并用絕緣層覆蓋。樣品提取液自動(dòng)加入干燥的微量滴定孔中，結(jié)果可在18 min內(nèi)獲得。該方法快速、簡(jiǎn)單，可用作高通量篩選方法。Godoy-Navajas等[54]描述了一種新型的熒光測(cè)定技術(shù)并運(yùn)用了新的替代標(biāo)簽檢測(cè)牛奶中的莫能菌素，示蹤劑由功能化納米顆粒與抗體組成。使用納米顆粒進(jìn)行長(zhǎng)波長(zhǎng)熒光測(cè)量，可以提供光譜選擇性從而避免樣品基質(zhì)的干擾。實(shí)踐證明，該方法具有自動(dòng)化程度高、樣品和試劑體積小等優(yōu)點(diǎn)。

相關(guān)方法的總結(jié)見(jiàn)表4。

表4 FPIA和TrFIA法在檢測(cè)抗球蟲(chóng)藥物殘留中的應(yīng)用

4 生物傳感器

生物傳感器(biosensor)是一種將生物識(shí)別元件(酶[55-56]、抗體[57]、抗原、細(xì)胞、核酸等)、理化換能器和信號(hào)放大裝置緊密結(jié)合的儀器[58](圖1D)。生物傳感器的特點(diǎn)是生物分子之間的特異性結(jié)合，例如抗原與抗體，底物與酶，受體與其特異性配體，為了檢測(cè)這些生物分子之間的相互作用，生物傳感器使用感測(cè)裝置或換能器將生物信號(hào)轉(zhuǎn)換成電信號(hào)，該電信號(hào)由處理器放大、存儲(chǔ)和量化[59]。對(duì)于獸藥殘留檢測(cè)，最常用的生物元素是抗體-抗原親和對(duì)，在這種情況下，生物傳感器稱為免疫傳感器[60]。Huet等[61]詳細(xì)地描述了用不同類型的生物傳感器檢測(cè)和定量抗微生物化合物。

抗球蟲(chóng)藥物的免疫傳感器檢測(cè)方法報(bào)道較少。McCarney等[62]用表面等離子體共振(SPR)生物傳感器檢測(cè)雞肝和雞蛋中尼卡巴嗪的殘留量。他們使用DNC(尼卡巴嗪的組成成分之一)的結(jié)構(gòu)模擬物在兔中產(chǎn)生抗血清，并將同一化合物的另一種模擬物固定在CM5傳感器芯片上?？梢詸z測(cè)到抗體與芯片表面結(jié)合，當(dāng)有DNC時(shí)結(jié)合被抑制。芯片表面是使用堿和有機(jī)溶劑的組合再生的，并且在數(shù)百次進(jìn)樣中非常穩(wěn)定。一個(gè)分析周期(樣品進(jìn)樣、芯片再生和系統(tǒng)清洗)需要7 min就能完成。同時(shí)，他們介紹了生物傳感器技術(shù)與LC-MS的對(duì)比研究結(jié)果。兩種方法對(duì)于DNC含量的測(cè)定顯示出良好的一致性，該方法可快速去除陰性樣品，確認(rèn)陽(yáng)性樣品，而LC-MS分析所需的時(shí)間更長(zhǎng)。該程序具有良好的選擇性和靈敏度，可檢測(cè)出遠(yuǎn)低于既定的MRL或差動(dòng)限制(differential action limit, DAL)水平的家禽肝和雞蛋中的尼卡巴嗪殘留標(biāo)記物DNC。Hu 等[63]首次開(kāi)發(fā)了一種基于AuNPs/Zn/Ni-ZIF-8-800 @石墨烯復(fù)合材料的高效、靈敏的電化學(xué)免疫傳感器，用于檢測(cè)牛奶中的莫能菌素。AuNP具有良好的兼容性，可用于固定抗莫能菌素的單克隆抗體，并起到放大信號(hào)的作用。這種新型的信號(hào)放大免疫傳感器檢測(cè)方法具有高靈敏度和優(yōu)異的選擇性，與其他藥物無(wú)明顯的交叉反應(yīng)，但該方法并沒(méi)有應(yīng)用到實(shí)際樣本的檢測(cè)。詳見(jiàn)表5。

表5 生物傳感器分析技術(shù)檢測(cè)抗球蟲(chóng)藥物殘留的應(yīng)用

5 小結(jié)與展望

抗球蟲(chóng)藥物的種類繁多，且養(yǎng)殖場(chǎng)中常作為飼料添加劑使用，長(zhǎng)期食用含有低劑量抗球蟲(chóng)藥的動(dòng)物性食品會(huì)危害人類的健康，建立靈敏度高、成本低、操作簡(jiǎn)便、可同時(shí)檢測(cè)的快速檢測(cè)方法成為發(fā)展趨勢(shì)?？骨蛳x(chóng)藥物的樣品前處理過(guò)程一般選用乙腈或甲醇進(jìn)行液-液萃取。免疫檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)便，方法設(shè)計(jì)較為靈活，通過(guò)不同的信號(hào)放大系統(tǒng)，如熒光信號(hào)，能量變化，分子量大小的改變，這些都能使儀器檢測(cè)到藥物信號(hào)從而對(duì)樣品進(jìn)行快速的高通量篩選。如今適用性高，應(yīng)用廣泛的免疫檢測(cè)技術(shù)為傳統(tǒng)的ELISA檢測(cè)方法和試紙條。對(duì)于需要進(jìn)行生物信號(hào)轉(zhuǎn)換的免疫檢測(cè)方法，其靈敏度以及選擇性高于傳統(tǒng)的檢測(cè)方法，但在實(shí)際樣品檢測(cè)過(guò)程中有一定的限制，并且很少能夠廣泛應(yīng)用于畜牧養(yǎng)殖場(chǎng)中。目前，各種免疫檢測(cè)技術(shù)都要依賴于抗體的特性，性能優(yōu)異的抗體對(duì)免疫檢測(cè)技術(shù)的效果起到了關(guān)鍵性作用，而如今同時(shí)檢測(cè)多種抗球蟲(chóng)藥物殘留的快速檢測(cè)方法報(bào)道較少。因此，可以將以下幾個(gè)方面作為研究重點(diǎn)：1)建立非均相體系的免疫檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)多殘留檢測(cè)。2)通過(guò)基因重組技術(shù)設(shè)計(jì)可識(shí)別多種藥物的抗體。3)設(shè)計(jì)半抗原并合成抗原，以得到特異性強(qiáng)、靈敏度高的抗體。