羅莉 周磊 丁衍 羅林紫 盧志斌 馮丹 柳廣南 肖陽(yáng)寶

目前我國(guó)良性氣管支氣管狹窄的病因以氣管支氣管結(jié)核( tracheobronchial tuberculosis，TBTB)居首位。約90%的TBTB患者合并有不同程度的增生性或瘢痕性氣管支氣管狹窄[1-3]。SIRT-1是存在于生物體的胞核和胞質(zhì)中的一種核蛋白，屬于沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶(Sir2-related enzymes sirtuins)家族,是NAD+依賴(lài)的Ⅲ型組蛋白去乙?；?，具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，包括抑制炎癥、細(xì)胞生長(zhǎng)、內(nèi)分泌信號(hào)、延長(zhǎng)壽命等[4-5]?，F(xiàn)有細(xì)胞及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)、I型膠原蛋白(COL-1)在良性氣管支氣管狹窄形成過(guò)程中可促進(jìn)炎癥反應(yīng)及纖維化[6]，而布地奈德、紅霉素等抗炎藥物可升高SIRT-1的表達(dá)進(jìn)而減輕氣管支氣管炎癥及瘢痕增生[7-8]。本研究將通過(guò)臨床標(biāo)本探討SIRT-1在結(jié)核性氣管支氣管狹窄形成中的作用，為臨床防治結(jié)核性氣管支氣管狹窄提供理論依據(jù)和新思路。

資料與方法

一、 研究對(duì)象

1 分組：①正常對(duì)照組(A)：于無(wú)吸煙、無(wú)肺癌的肺曲菌球患者行肺葉切除術(shù)中，留取正常支氣管殘端的氣管支氣管內(nèi)膜組織(20例)，②增生組(B)：增生性結(jié)核性氣管支氣管狹窄組(20例)，在抗結(jié)核藥物治療1周后行支氣管鏡檢查，活檢鉗取氣管支氣管病灶處肉芽及內(nèi)膜組織；③瘢痕組(C)：瘢痕性結(jié)核性氣管支氣管狹窄組(20例)，在抗結(jié)核藥物治療過(guò)程中表現(xiàn)為需支氣管鏡下球囊擴(kuò)張術(shù)治療的瘢痕狹窄型TBTB，活檢鉗取氣管支氣管瘢痕組織。

2 納入標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)《肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)》(WS 288—2017)確診活動(dòng)性肺結(jié)核患者；經(jīng)支氣管鏡檢查和(或)病理學(xué)、細(xì)菌學(xué)檢查確診為T(mén)BTB的初治患者。

3 排除標(biāo)準(zhǔn)：①先天性氣管支氣管狹窄者，腫瘤、結(jié)締組織疾病所致氣管支氣管狹窄者、氣管切開(kāi)、氣管插管、異物所致氣管支氣管狹窄。②7天內(nèi)使用大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物、激素和免疫抑制或增強(qiáng)物治療者須停藥一周。③耐結(jié)核藥的肺結(jié)核合并TBTB患者。④肺結(jié)核合并TBTB復(fù)治患者。

二、 主要材料

SIRT-1 ELISA試劑盒(武漢華美生物工程有限公司)；IL-8 、TGF-β1ELISA試劑盒(上海Proteintech 公司)；聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)引物(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)；總RNA提取試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT qPCR)試劑盒(中國(guó)大連TAKARA公司)；鼠抗β肌動(dòng)蛋白單克隆抗體、兔抗SIRT-1(上海Proteintech 公司)；兔抗COL-1、兔抗TGF-β1(英國(guó)Abcam公司)。

三、 研究方法

1 運(yùn)用ELISA檢測(cè)血清中SIRT-1、TGF-β1、IL-8的表達(dá)水平(A組血清標(biāo)本取自正常體檢人群，B組及C組血清標(biāo)本取自患者抗結(jié)核藥物治療前)。

2 免疫組化：各組支氣管內(nèi)膜組織予以4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、切片后，通過(guò)免疫組化檢測(cè)TGF-β1、COL-1、SIRT1蛋白表達(dá)情況，通過(guò)光學(xué)顯微鏡拍片后，使用 ImagePro Plus 6.0 對(duì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行分析。

3 用Western印跡法檢測(cè)SIRT1、TGF-β1、COL-1蛋白表達(dá)水平：提取組織蛋白，經(jīng)BCA法蛋白定量后上樣，SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì)，分別切膠SIRT-1(110-130KD)，COL-I(100-130KD)，TGF-β1(44KD)β-actin(42KD)轉(zhuǎn)膜并封閉，一抗孵育SIRT-1(1 ∶750)、TGF-β1(2ug/mL)、COL-1(1 ∶4000)，β-actin(1 ∶5000)；用Quantity One軟件分析目的蛋白和β-actin的吸光度值，以目的蛋白與β-actin吸光度值的比值作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

4 運(yùn)用實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)檢測(cè)SIRT1、TGF-β1、COL-1mRNA的相對(duì)表達(dá)量：Trizol提取組織總RNA，瓊脂糖凝膠電泳，以組織總mRNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄cDNA，SYBR法行RT-qPCR實(shí)驗(yàn)(見(jiàn)表1)。

表1 引物序列

四、 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、 各組血清中SIRT-1、TGF-β1、IL-8的表達(dá)

血清SIRT-1濃度增生組低于瘢痕組，瘢痕組低于正常組；血清TGF-β1濃度增生組高于瘢痕組，瘢痕組高于正常組；血清IL-8濃度增生組及瘢痕組高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；血清IL-8濃度增生組高于瘢痕組，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)表2)。

二、 各組氣管支氣管組織中SIRT-1、TGF-β1、COL-1mRNA相對(duì)表達(dá)量

SIRT-1mRNA相對(duì)表達(dá)量，增生組低于瘢痕組，瘢痕組低于正常組； COL-1、TGF-β1mRNA相對(duì)表達(dá)量，增生組高于瘢痕組，瘢痕組高于正常組；差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表3)。

表2 各組血清中SIRT-1、TGF-β1、IL-8濃度的比較

表3 各組氣管支氣管組織中SIRT-1、TGF-β1、COL-1mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較

三、各組氣管支氣管組織中SIRT-1、TGF-β1、COL-1蛋白陽(yáng)性表達(dá)

SIRT-1(圖1：A、B、C)主要定位于細(xì)胞核，陽(yáng)性被染成棕黃色或棕色，TGF-β1(圖1：D、E、F)、COL-1(圖1：G、H、I)主要定位于細(xì)胞漿。SIRT-1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率增生組低于瘢痕組，瘢痕組低于正常組； TGF-β1、COL-1陽(yáng)性表達(dá)率增生組高于瘢痕組和正常組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；但瘢痕組與正常組的比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表4)。

四、Western blot檢測(cè)各組氣管支氣管組織中SIRT-1、TGF-β1、COL-1蛋白的表達(dá)

SIRT-1蛋白表達(dá)量增生組低于瘢痕組，瘢痕組低于正常組； TGF-β1蛋白表達(dá)量增生組高于瘢痕組，瘢痕組高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；COL-1蛋白表達(dá)量增生組高于正常組(P<0.05)，余組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，(表5，圖2)。

表4 各組氣管支氣管組織免疫組化結(jié)果

表5 各組氣管支氣管組織中SIRT-1、TGF-β1、COL-1蛋白表達(dá)量的比較

討 論

結(jié)核分枝桿菌Mycobacterium tuberculosis (Mtb) 的成份、遺傳因素、抗結(jié)核分枝桿菌的免疫反應(yīng)等因素，導(dǎo)致白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-8(IL-8)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、γ-干擾素(IFN-γ)等細(xì)胞或炎癥因子的釋放，造成成纖維細(xì)胞過(guò)度增殖、肉芽組織增生、I型、II型膠原纖維(COL-1、COL-3)合成增多和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)沉積，可能導(dǎo)致了結(jié)核性氣管支氣管狹窄[9-12]。前期

圖1 各組氣管支氣管組織中SIRT-1、TGF-β1、COL-1的蛋白表達(dá)(免疫組化×400)

圖2 各組支氣管組織中蛋白的表達(dá)

研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1、VEGF、核因子-κB(NF-κB)在增生性結(jié)核性氣管支氣管狹窄組的表達(dá)高于瘢痕性結(jié)核性氣管支氣管狹窄組及正常對(duì)照組,表明氣管支氣管炎癥參與了結(jié)核性氣管支氣管狹窄的發(fā)生[6]。

在肺部疾病中， 血清SIRT-1濃度在慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者中表達(dá)下調(diào)[13]，哮喘患者中表達(dá)上調(diào)[14]，提高SIRT-1的表達(dá)及活性，能抑制COPD和哮喘相關(guān)的肺部炎癥[13-15]。SIRT1表達(dá)升高還可抑制肺癌細(xì)胞凋亡[16]，減輕肺纖維化[17]。血清SIRT-1濃度在肺結(jié)核患者中表達(dá)下調(diào)[18-19]，Cheng等[18]學(xué)者證明Mtb感染會(huì)使巨噬細(xì)胞中SIRT-1的表達(dá)減少，SIRT-1活化通過(guò)誘導(dǎo)吞噬體-溶酶體融合和自噬減少M(fèi)tb的細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)，通過(guò)NK-κB亞單位RelA / p65的脫乙酰導(dǎo)致RelA / p65與炎性基因啟動(dòng)子(TNF-α，IL-1β，MCP-1)的結(jié)合受損，抑制NK-κB介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)；使用SIRT-1激活劑白藜蘆醇可減輕炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及肉芽增殖，改善Mtb感染小鼠的肺病理?yè)p傷。Yang等[19]學(xué)者表明Mtb感染對(duì)SIRT-1表達(dá)的抑制作用增強(qiáng)了轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β-活化的激酶1(TAK1)的激活，進(jìn)而通過(guò)激活p65 / p38 / JNK / ERK信號(hào)通路，增強(qiáng)了IL-6和TNF-α的分泌；而用白藜蘆醇治療的小鼠SIRT-1表達(dá)上調(diào)可抑制TAK1，MAPK和NF-κB途徑的激活，降低促炎性細(xì)胞因子的水平。

本研究發(fā)現(xiàn)活動(dòng)期TBTB患者血清SIRT-1濃度較正常人低，同時(shí)血清中TGF-β1、IL-8表達(dá)較正常人高。首次檢測(cè)TBTB患者氣管支氣管內(nèi)膜組織中SIRT-1的表達(dá)，分別從蛋白及mmRNA水平證明SIRT-1參與了結(jié)核性氣管支氣管狹窄的發(fā)生發(fā)展；不管是增生性或瘢痕性狹窄中SIRT-1的表達(dá)都較正常人要低，而增生性狹窄時(shí)低表達(dá)最明顯，同時(shí)TGF-β1、COL-1的表達(dá)和SIRT-1的表達(dá)呈相反趨勢(shì)；考慮增生性狹窄是TBTB受損的氣管支氣管黏膜表現(xiàn)為明顯的充血水腫、潰瘍壞死及肉芽增殖，由于Mtb毒性大、破壞性強(qiáng)，對(duì)氣管壁持續(xù)反復(fù)的破壞并影響其組織修復(fù)，Mtb可能抑制SIRT-1的表達(dá)，加重炎癥反應(yīng)及纖維化。而經(jīng)過(guò)全身抗結(jié)核治療及支氣管鏡下介入治療后，Mtb活動(dòng)性降低、毒力減弱，壞死物及肉芽被清除、腫脹消退后對(duì)氣管支氣管黏膜炎性刺激及結(jié)構(gòu)破壞作用減弱，Mtb抑制SIRT-1表達(dá)的作用也減弱，SIRT-1活性恢復(fù)后，氣管支氣管受損部位的炎癥反應(yīng)及纖維化隨之減弱，黏膜修復(fù)，表現(xiàn)為瘢痕性狹窄。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，不管是細(xì)胞、動(dòng)物、人體在受到Mtb感染時(shí)會(huì)抑制SIRT-1的表達(dá)，進(jìn)而引起過(guò)度炎癥反應(yīng)及纖維化。

SIRT-1可能成為結(jié)核性氣管支氣管狹窄防治的新靶點(diǎn)，但研究還需進(jìn)一步通過(guò)細(xì)胞及動(dòng)物水平驗(yàn)證其相關(guān)作用機(jī)制。由于受醫(yī)學(xué)倫理的限制，缺憾的是無(wú)法取得正常人氣管支氣管內(nèi)膜組織進(jìn)行研究。建立TBTB的動(dòng)物模型具有難度，可通過(guò)成熟的良性氣管支氣管狹窄動(dòng)物模型探索。另外在全身抗結(jié)核治療的基礎(chǔ)上，抗炎藥物是否能減輕TBTB的炎癥反應(yīng)及纖維化，起到干預(yù)結(jié)核瘢痕狹窄進(jìn)程的作用，還有待考證。

總之，結(jié)核性氣管支氣管狹窄的形成可能與SIRT-1的表達(dá)受到Mtb抑制，促使受損氣管支氣管黏膜炎癥反應(yīng)及纖維化加重有關(guān)。