蔣源 陳紅梅 易恒仲 黃軍

支氣管狹窄是常見的支氣管結(jié)核并發(fā)癥，常見癥狀為呼吸困難，嚴(yán)重時可引發(fā)呼吸衰竭或窒息性死亡[1]。遺傳、結(jié)核分枝桿菌以及抗結(jié)核分枝桿菌的免疫反應(yīng)，造成成纖維細(xì)胞過度增殖、膠原纖維合成增多以及細(xì)胞外基質(zhì)沉積可導(dǎo)致氣道狹窄[2-3]。采取有效的措施減少或抑制成纖維細(xì)胞增殖和膠原纖維的增加是防治氣道狹窄的關(guān)鍵步驟[4]。沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulator 1，SIRT1)是NAD+依賴性脫乙酰基酶，在多種疾病的病理進(jìn)展和治療中發(fā)揮復(fù)雜的功能[5-6]。本研究通過檢測結(jié)核性氣道狹窄患者的氣道增生肉芽組織中SIRT1的表達(dá)，并進(jìn)一步分析沉默氣管成纖維細(xì)胞中SIRT1基因表達(dá)對轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β,TGF-β1)誘導(dǎo)下的細(xì)胞增殖與分化的影響，為結(jié)核性氣道狹窄的診治研究奠定基礎(chǔ)。

資料與方法

一、 主要材料與試劑

人原代氣管成纖維細(xì)胞購自武漢Procell公司。胎牛血清、青霉素、鏈霉素、胰蛋白酶和DMEM培養(yǎng)基購自美國 Gibco 公司，Lipofectamine RNAiMAX 轉(zhuǎn)染試劑盒購自上?；鄯f生物科技有限公司，免疫組化染色試劑購自上海古朵生物科技有限公司，Trizol試劑盒、Prime ScriptTM RT reagent Kit試劑盒及SYBR?Premix Ex TaqTM II試劑盒購自日本Takara公司，TGF-β1購自美國PeproTech公司，免疫熒光染色試劑購自上海晶天生物科技有限公司，CCK-8 試劑盒、碘化丙啶、RIPA裂解液、BCA試劑盒、PVDF膜以及ECL發(fā)光液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，抗體SIRT1、TNF-α、α-SMA以及辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗兔購自美國Abcam公司，抗體PCNA、CoL-Ⅰ、CoL-Ⅲ以及β-actin購自北京中杉金橋生物有限公司。

二、 標(biāo)本收集

收集我院2018年5月～2019年12月住院的40例結(jié)核性增生性氣道狹窄患者的氣道增生肉芽組織，作為結(jié)核性氣道狹窄組，同時取20例正常支氣管組織作為正常對照組。所有患者及家屬均簽署了知情同意書。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)支氣管鏡檢查與細(xì)菌學(xué)確診的結(jié)核性增生性氣道狹窄患者；②所有患者均未行抗結(jié)核治療；③正常對照組為在我院體檢健康正常者。病例排除標(biāo)準(zhǔn)：①先天性氣道狹窄以及氣道腫瘤、結(jié)締組織疾病以及其他原因所致氣道狹窄者；②耐藥結(jié)核分枝桿菌、非結(jié)核分枝桿菌及合并人類免疫缺陷病毒感染者；③灌洗液病原菌培養(yǎng)為陽性者；④合并活動性肺結(jié)核、合并結(jié)核性胸膜炎、淋巴結(jié)結(jié)核等肺外結(jié)核患者；⑤一周內(nèi)使用激素治療者。

三、 免疫組化染色

將氣道增生肉芽組織置于4%多聚甲醛中固定，采用梯度乙醇脫水，浸于二甲苯中透明，進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋，切成4 μm的石蠟切片。組織切片脫蠟至水后，滴加2%乙二胺四乙酸(EDTA)溶液，在高溫下進(jìn)行抗原修復(fù)，采用3%H2O2去除內(nèi)源性過氧化物酶，然后滴加一抗SIRT1(1 ∶200)與TNF-α(1 ∶200)，在4℃ 孵育過夜，次日PBS 沖洗，滴加二抗(1 ∶1000)后在溫下孵育1 h，PBS 再次沖洗后，加入DAB進(jìn)行染核，并使用蘇木精復(fù)染，采用中性樹膠封片，于電鏡下觀察組織中SIRT1與TNF-α陽性表達(dá)，以染成棕黃色至棕色為陽性表達(dá)。

四、 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

氣管成纖維細(xì)胞復(fù)蘇后，加入含10%胎牛血清、青霉素(100 U/mL)/鏈霉素(100 μg/mL)雙抗液的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)到80%時，0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，進(jìn)行傳代。將對數(shù)生長期的細(xì)胞按 4×103個細(xì)胞/孔的密度接種96孔板，每組設(shè)置5個復(fù)孔，置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育過夜。實(shí)驗(yàn)分為空白對照組、siRNA-NC組、siRNA-SIRT1組，根據(jù)Lipofectamine RNAiMAX 轉(zhuǎn)染試劑盒說明書將siRNA-SIRT1及siRNA-NC序列轉(zhuǎn)染至細(xì)胞，在37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h 后，更換為新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng) 48 h后收集細(xì)胞。

五、 實(shí)時熒光定量PCR

根據(jù)TRIzol試劑盒說明提取各處理組氣管成纖維細(xì)胞總RNA，Nanodrop測定RNA的純度和濃度。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime ScriptTM RT reagent Kit將總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用SYBR?Premix Ex TaqTM II試劑盒進(jìn)行qRT-PCR，檢測細(xì)胞中各基因 mRNA的表達(dá)情況，以β-actin為內(nèi)參基因。擴(kuò)增條件為：95℃ 3 min，1個循環(huán)；95℃ 30 s、60℃ 30 s、58℃ 30 s，42個循環(huán)。使用2-ΔΔCt法來計算各基因mRNA的相對表達(dá)量。引物由上海生工生物工程有限公司合成，序列為：SIRT1上游引物5′-CAAAGGAGCAGATTAGTAGGCG-3′，下游引物5′-CTCTGGCATGCCACTCATAGG-3′， Col-Ⅰ上游引物5′-CATGGTGACAAGGGTGAGAG-3′，下游引物5′- GGATGTTCTCGATCTGCTGG-3′，Col-Ⅲ 上游引物5′-GAATGCCGGAGAAAGAGG-3′，下游引物5′-TCTCGGGTTTCCACACGTCTC-3′，β-actin上游引物5′-ACCAACTGGGACGACATGGAG-3′ ，下游引物5′-TGGTGGTGAAGCTGTAGCC-3′。

六、 Western blot

在各處理組氣管成纖維細(xì)胞中加入RIPA裂解液提取總蛋白，BCA試劑盒對蛋白進(jìn)行定量。采用10% SDS-PAGE凝膠分離蛋白質(zhì)，并轉(zhuǎn)至PVDF膜。使用5%脫脂奶粉在室溫下封閉2 h，TBST洗膜后，滴入稀釋后的一抗SIRT1(1 ∶1 000)、PCNA(1 ∶1 000)、α-SMA(1 ∶2 000)、Col-Ⅰ(1 ∶2 000)、Col-Ⅲ(1 ∶2 000)以及內(nèi)參鼠抗β-actin(1 ∶5 000)，4℃下孵育過夜。次日，TBST洗膜，然后滴入二抗，置于室溫孵育1 h，TBST再次洗膜，并滴加ECL發(fā)光液顯色曝光， Image Pro Plus分析各蛋白條帶灰度值。

七、 CCK-8

將氣管成纖維細(xì)胞密度調(diào)整至5×105/mL，取100 μl接種至96孔板，置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁后，進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)染48 h后，吸去上清。實(shí)驗(yàn)設(shè)置空白對照組、TGF-β1 組、siRNA-NC+TGF-β1組、siRNA-SIRT1+TGF-β1組。除空白對照組外，其余每孔加入5 ng/mL TGF-β1 刺激48 h，然后更換為100 μL新鮮培養(yǎng)基，分別加入10% CCK-8試劑，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后取出，采用全自動酶標(biāo)儀檢測各孔光密度(OD)值，檢測波長為450 nm。

八、 流式細(xì)胞術(shù)

將轉(zhuǎn)染48 h并用TGF-β1刺激的氣管成纖維細(xì)胞用 PBS 洗滌，預(yù)冷的75%乙醇重懸細(xì)胞，并在-20 ℃下固定24 h，PBS再次洗滌并重懸細(xì)胞，每組取 450 μl 細(xì)胞懸液，加2 μl RNase后，37 ℃下孵育 10 min，接著加500 μl 碘化丙啶(PI)，置于37 ℃下避光孵育30 min，過300目篩網(wǎng)，通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期分布情況。

九、免疫熒光染色

將氣管成纖維細(xì)胞以 1×104個/孔鋪于24孔板內(nèi)的無菌玻片上，培養(yǎng) 24 h 后，進(jìn)行轉(zhuǎn)染48 h并用TGF-β1刺激后收集細(xì)胞，使用PBS洗滌細(xì)胞，加入4%多聚甲醛室溫固定15 min，滴加 0.5% TritonX-100 透化處理15 min，然后加入 10%山羊血清室溫封閉2 h，滴加稀釋的一抗抗體α-SMA(1 ∶150)在 4℃下孵育過夜，次日，棄去一抗使用PBS洗滌后，滴加對應(yīng)的熒光二抗(1 ∶1000)，室溫避光孵育1 h，洗滌并滴加 DAPI染細(xì)胞核 10 min，再次洗滌并封片，于熒光顯微鏡下觀察α-SMA表達(dá)情況。

十、 統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、 各組支氣管組織SIRT1與TNF-α的表達(dá)測

免疫組化染色結(jié)果(見圖1)所示，結(jié)核性氣道狹窄的氣道增生肉芽組織中具有明顯的棕黃色至棕色染色，統(tǒng)計結(jié)果表明結(jié)核性氣道狹窄組中SIRT1與TNF-α陽性表達(dá)率分別為95.0%(38/40)、97.5%(39/40)，較正常對照組中SIRT1、TNF-α陽性表達(dá)率10.0%(2/20)、5.0%(1/20)明顯增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 免疫組化染色檢測各組支氣管組織中SIRT1與TNF-α的表達(dá)(×200)

二、 各組氣管成纖維細(xì)胞SIRT1 mRNA與蛋白表達(dá)檢測

qRT-PCR和Western blot 檢測結(jié)果(見圖2、表1)所示，與空白對照組比較，siRNA-SIRT1組氣管成纖維細(xì)胞中SIRT1 mRNA和蛋白相對表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)?？瞻讓φ战M與siRNA-NC 組SIRT1 mRNA及蛋白相對表達(dá)水平之間無顯著差異(P>0.05)。

圖2 Western blot檢測細(xì)胞SIRT1蛋白表達(dá)

表1 各組氣管成纖維細(xì)胞中SIRT1 mRNA與蛋白表達(dá)水平比較

三、 siRNA轉(zhuǎn)染后各組氣管成纖維細(xì)胞增殖水平比較

CCK-8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果(見表2)所示，與空白對照組比較，TGF-β1組的氣管成纖維細(xì)胞增殖水平顯著增加(P<0.05)。與TGF-β1組比較，siRNA-SIRT1+TGF-β1組細(xì)胞增殖水平顯著降低(P<0.05)，siRNA-NC+TGF-β1組與TGF-β1組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表2 各組氣管成纖維細(xì)胞吸光度值比較

四、 siRNA轉(zhuǎn)染后各組氣管成纖維細(xì)胞周期分布

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果(見圖3、表3)所示，與空白對照組比較，TGF-β1組的氣管成纖維細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞比例顯著增加，而S期細(xì)胞比例顯著減少(P<0.05)。siRNA-SIRT1+TGF-β1組較TGF-β1組G0/G1期細(xì)胞比例顯著減少，同時S期細(xì)胞比例顯著增加(P<0.05)，siRNA-NC+TGF-β1組各期細(xì)胞比例與TGF-β1組各期細(xì)胞比例之間無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。

表3 各組氣管成纖維細(xì)胞周期分布比例比較

五、 siRNA轉(zhuǎn)染后各組氣管成纖維細(xì)胞α-SMA熒光染色比較

免疫熒光染色結(jié)果(見圖4)所示，TGF-β1組α- SMA 特異性免疫細(xì)胞化學(xué)陽性染色較空白對照組明顯增加。與TGF-β1組比較，siRNA-NC+TGF-β1組α-SMA 特異性免疫細(xì)胞化學(xué)陽性染色無明顯變化，而siRNA-SIRT1+TGF-β1組α-SMA 特異性免疫細(xì)胞化學(xué)染色陽性明顯減弱。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測氣管成纖維細(xì)胞周期分布情況

圖4 免疫熒光染色檢測各組氣管成纖維細(xì)胞中α-SMA表達(dá)(×200)

六、 siRNA轉(zhuǎn)染后各組氣管成纖維細(xì)胞中PCNA、TNF-α、CoL-Ⅰ、CoL-Ⅲ蛋白表達(dá)比較

Western blot檢測結(jié)果(見圖5、表4)所示，與空白對照組比較，TGF-β1組的氣管成纖維細(xì)胞中PCNA、TNF-α、CoL-Ⅰ、CoL-Ⅲ 的蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)。siRNA-SIRT1+TGF-β1組PCNA、TNF-α、CoL-Ⅰ、CoL-Ⅲ 的蛋白表達(dá)水平較TGF-β1組均顯著下降(P<0.05)，而siRNA-NC+TGF-β1組與TGF-β1組各蛋白表達(dá)水平間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

圖5 Western blot檢測各組氣管成纖維細(xì)胞中PCNA、TNF-α、CoL-Ⅰ、CoL-Ⅲ蛋白表達(dá)

表4 各組氣管成纖維細(xì)胞PCNA、TNF-α、CoL-Ⅰ、CoL-Ⅲ蛋白表達(dá)水平比較

七、 siRNA轉(zhuǎn)染后各組氣管成纖維細(xì)胞中CoL-Ⅰ、CoL-Ⅲ mRNA表達(dá)比較

qRT-PCR檢測CoL-Ⅰ、CoL-Ⅲ mRNA表達(dá)水平，結(jié)果(見表5)，TGF-β1組的氣管成纖維細(xì)胞中CoL-Ⅰ、CoL-Ⅲ mRNA相對表達(dá)水平較空白對照組顯著升高(P<0.05)。而與TGF-β1組比較，siRNA-SIRT1+TGF-β1組CoL-Ⅰ、CoL-Ⅲ mRNA相對表達(dá)水平顯著下降(P<0.05)，siRNA-NC+TGF-β1組與TGF-β1組間無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)(見表5)。

表5 各組氣管成纖維細(xì)胞CoL-Ⅰ、CoL-Ⅲ mRNA表達(dá)水平比較

討 論

氣道狹窄的特征是氣道直徑逐漸減小，許多原因引發(fā)的氣道感染可引起氣管或支氣管黏膜損傷從而導(dǎo)致異常上皮的再形成，然后正常的氣管壁組織被纖維組織所替代，致使氣道狹窄的發(fā)生[3-4]。這些原因主要包括結(jié)核病、真菌感染、細(xì)菌性氣管炎、組織胞漿菌病以及白喉，其中最常見的是結(jié)核病[7]。深入研究結(jié)核性氣道狹窄的發(fā)病機(jī)制，發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)，對于結(jié)核性氣道狹窄的治療具有重大意義。

組蛋白脫乙?；?histone deacetylase ，HDAC)是一類可催化從組蛋白和非組蛋白中去除N-乙酰-L-賴氨酸氨基酸殘基中的乙酰基，并抑制組蛋白乙酰化的酶[8]。Sirtuins是高度保守的NAD依賴的Ⅲ類組蛋白脫乙?；?，SIRT1作為研究較為廣泛的組蛋白脫乙?；傅某蓡T，已有研究表明，SIRT1能夠調(diào)節(jié)肝、胰腺和腦組織中的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)[9-11]。此外，Dvir-Ginzberg等人發(fā)現(xiàn)軟骨細(xì)胞中SIRT1表達(dá)水平的升高導(dǎo)致軟骨特異性基因聚集蛋白聚糖、2型膠原和9型膠原表達(dá)急劇增加，而SIRT1水平降低后則顯著抑制了這些基因的表達(dá)[12]。Simic等人的研究表明乳腺癌細(xì)胞中SIRT1能夠負(fù)調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)型，從而促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡，抑制癌細(xì)胞擴(kuò)散與轉(zhuǎn)移[13]。

本研究通過檢測結(jié)核性氣道狹窄患者的氣道增生肉芽組織中SIRT1表達(dá)發(fā)現(xiàn)，該組織中SIRT1表達(dá)異常增高。接著，通過沉默體外培養(yǎng)的氣管成纖維細(xì)胞中 SIRT1 基因的表達(dá)，檢測細(xì)胞增殖的變化情況，研究結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染了SIRT1 siRNA的氣管成纖維細(xì)胞中，細(xì)胞增殖明顯受限，G0/G1期細(xì)胞比例減少，使得細(xì)胞阻滯于S期。PCNA作為反映細(xì)胞增殖的標(biāo)志物，其表達(dá)水平的升高表明細(xì)胞增殖活躍[14]。本研究結(jié)果同樣顯示，在沉默氣管成纖維細(xì)胞中SIRT1表達(dá)后，細(xì)胞中PCNA蛋白表達(dá)明顯下降。以上結(jié)果均表明，沉默SIRT1表達(dá)可抑制氣管成纖維細(xì)胞的增殖速度。

α-SMA是平滑肌細(xì)胞的標(biāo)志物，研究中常用來反映成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞以及肌成纖維細(xì)胞收縮能力的改變，其表達(dá)水平升高表明膠原蛋白的合成增加[15]。CoL-Ⅰ與CoL-Ⅲ是肌細(xì)胞外間質(zhì)主要成分，膠原蛋白的表達(dá)上調(diào)會引起細(xì)胞外基質(zhì)沉積，導(dǎo)致組織功能受損[16]。本研究結(jié)果表明，氣管成纖維細(xì)胞在TGF-β1 誘導(dǎo)下α-SMA、CoL-Ⅰ、CoL-Ⅲ表達(dá)水平均升高，而在沉默細(xì)胞中SIRT1表達(dá)后，α-SMA、CoL-Ⅰ及CoL-Ⅲ表達(dá)水平降低。此外，本研究檢測發(fā)現(xiàn)氣道增生肉芽組織中TNF-α表達(dá)增加，而沉默氣管成纖維細(xì)胞中SIRT1表達(dá)后，TNF-α表達(dá)下調(diào)。研究表明，TNF-α作為重要的細(xì)胞因子參與炎癥反應(yīng)，促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖及分化，并促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成[17]。這一結(jié)果提示沉默SIRT1能夠抑制膠原合成和細(xì)胞外基質(zhì)堆積，阻止結(jié)核性氣道狹窄的發(fā)展。

綜上所述，本研究揭示了SIRT1在結(jié)核性氣道狹窄的氣道增生肉芽組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，而沉默氣管成纖維細(xì)胞中SIRT1表達(dá)后，可降低TGF-β1誘導(dǎo)下細(xì)胞增殖速度的加快，使細(xì)胞發(fā)生周期停滯，并抑制細(xì)胞的分化。但此過程中的具體作用機(jī)制還需進(jìn)行深入探究，以期為結(jié)核性氣道狹窄的診治提供新思路。