楊星雅 李鵬飛 李良 于濤 張衛(wèi)英

國家體育總局體育科學(xué)研究所（北京100061）

肥胖和代謝綜合癥是一種慢性炎癥狀態(tài)，脂肪組織的炎癥是誘發(fā)各種肥胖相關(guān)疾病的重要因素。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）可能是連接肥胖、慢性炎癥、外周胰島素抵抗的一個核心機制[1.2]。ERS 是指內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在某種應(yīng)激因素，例如缺氧等的刺激下，其穩(wěn)態(tài)被破壞，導(dǎo)致蛋白質(zhì)錯誤折疊或者過度合成，并在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中積聚的一種狀態(tài)[3]。未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR）就是其中最重要的一種。一般來說，UPR的發(fā)生即標志著ERS的發(fā)生。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上有三種重要的應(yīng)激感受蛋白受體，分別是類PKR 的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（PKR-like endoplasmic re?ticulum kinase，PERK），轉(zhuǎn)錄激活因子6 （activating transcription factor-6，ATF6）和肌醇需求激酶-1（inosi?tol requiring enzyme-1，IRE1）。這三種蛋白在正常狀態(tài)下與糖調(diào)節(jié)蛋白78/免疫球蛋白結(jié)合蛋白（glucose regulated proteins78/immunoglobul in binding protein，GRP78/Bip）結(jié)合[4]，當ERS 發(fā)生后，未折疊蛋白增加，GRP78 會與其結(jié)合，使得3 種應(yīng)激蛋白脫落，PERK 和IRE1 通過自身磷酸化，終止蛋白合成過程[5-6]；ATF6 脫落后轉(zhuǎn)位到高爾基體而被激活，進而減少蛋白堆積[7]，恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)[8]。但是，當內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過于劇烈或持久時，就會啟動細胞自噬和凋亡程序以及促炎轉(zhuǎn)錄程序[9]。一方面，ERS可以導(dǎo)致促炎癥因子如白介素-6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNFα）等的表達增加；另一方面，促炎癥因子可以進一步誘導(dǎo)ERS，從而產(chǎn)生惡性循環(huán)[10]。

超重與肥胖人群的皮下脂肪組織中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標識基因表達明顯增加[11，12]，但長期適度的有氧運動可改善細胞過度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[13]。有研究發(fā)現(xiàn)，抗阻運動也可以引起骨骼肌的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)[14]，但目前對脂肪組織的研究中，抗阻運動的研究很少。因此，本研究通過對高脂膳食誘導(dǎo)的肥胖大鼠進行有氧運動和抗阻運動，了解兩種運動方式對肥胖狀態(tài)下大鼠的脂肪組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)以及其炎癥反應(yīng)的影響。

1 材料和方法

1.1 肥胖大鼠模型的建立

3 周齡雄性SD 大鼠（北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司）70 只，普通飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，采用隨機數(shù)字表將大鼠隨機分為高脂組（60 只）和正常組（10只）。其中，高脂組大鼠用高脂飼料（D12451，Re?search Diets，New Jer．sey，USA）進行飼養(yǎng)，正常組大鼠用符合國家標準的嚙齒類動物普通飼料進行飼養(yǎng)。分籠飼養(yǎng)，喂養(yǎng)10～12周，自由進食和飲水，室溫18℃～24℃，濕度40%～60%，晝夜節(jié)律變化光照12 h∶12 h。12周后篩選建模成功的大鼠，篩選依據(jù)為：①高脂組大鼠體重高于正常組大鼠平均體重的20%，即為單純性肥胖大鼠[15]。②高脂組大鼠的Lee’s指數(shù)（即評價成年大鼠肥胖程度的指標，計算方法為：

Lee’s 指數(shù)=體重（g）^（1/3）/身長（cm），其中“身長”指大鼠鼻端到肛門的距離[16]）顯著高于正常組，③高脂組大鼠的血清總膽固醇和甘油三酯顯著高于正常組。

經(jīng)過篩選，共有33 只大鼠建模成功，成功率為55%。從建模成功的肥胖大鼠中隨機選取30 只分為3組：安靜對照組（C 組）、抗阻運動組（RE 組）、有氧運動組（AE組），每組10只。

1.2 訓(xùn)練方案

AE組大鼠用跑臺法進行8周的有氧運動干預(yù)，RE組大鼠利用負重爬梯法進行8周的抗阻運動干預(yù)，C組大鼠不進行運動干預(yù)。在此期間，3組大鼠均繼續(xù)利用高脂飼料喂養(yǎng)，大鼠維持自由進食和飲水。

1.2.1 抗阻運動方案（爬梯法）[17-19]

適應(yīng)性訓(xùn)練：3天，不加負重爬梯8次。正式訓(xùn)練：以大鼠體重的50%作為初始負荷，隨后每次遞增負荷30 g，直到完成8 次訓(xùn)練，若大鼠還未完成8 次訓(xùn)練就已經(jīng)無法爬到爬梯頂端，大鼠最后一次能夠成功爬上爬梯頂端的負重認為是本次訓(xùn)練的最大負荷。接下來的一輪訓(xùn)練的前4次負重分別為前次最大負荷的50%、75%、90%和100%，如果大鼠能夠完成這4 次訓(xùn)練，在隨后的爬梯訓(xùn)練中，每次遞增負荷30 g，直到大鼠成功爬梯8 次或無法爬到頂端，最后一次成功爬梯的負重為新的最大負荷，以此類推?？棺栌?xùn)練每3 天進行1次，共進行8周，訓(xùn)練期間每周稱量并記錄大鼠體重。

1.2.2 有氧運動方案（跑臺法）[18-21]

適應(yīng)性訓(xùn)練：5 天，跑臺（品牌：段氏跑臺，型號：DSPT202）速度為10 m/min，訓(xùn)練時間10 min。正式訓(xùn)練：共8 周，第1 周速度為15 m/min，訓(xùn)練20 min；在接下來的7周時間里，訓(xùn)練速度每周增速1.5 m/min，運動時間每周增加5 min，到第8 周訓(xùn)練速度增至25 m/min，訓(xùn)練時間增至60 min；整個訓(xùn)練過程跑臺坡度均為0°。每周一至周五訓(xùn)練，休息2 天。訓(xùn)練期間每周稱量并記錄大鼠體重。

1.2.3 樣品制備

在最后一次訓(xùn)練結(jié)束后48 h，用10%的水合氯醛溶液腹腔注射麻醉，取雙側(cè)腹股溝脂肪及雙側(cè)附睪脂肪，稱重并記錄后做好標記，立即放入液氮中迅速冷凍，然后置于－80℃保存。

潤光養(yǎng)生美容酒是中醫(yī)養(yǎng)生美容專家李潤光教授在祖?zhèn)黟B(yǎng)生美容寶典《回春部》的基礎(chǔ)上,結(jié)合現(xiàn)代中醫(yī)養(yǎng)生美容理論研制出來的一種可供內(nèi)服、外用的酒劑。它主要由烏梅、桂圓肉、枸杞、陳皮、黑棗、茯苓、佛手、羅漢果、山楂、花椒等中藥經(jīng)露酒浸泡制得。前期,本課題組已對其急性毒性以及抗炎鎮(zhèn)痛作用進行了研究,結(jié)果表明該酒的臨床常用口服劑量是安全的以及該酒具有顯著的抗炎鎮(zhèn)痛作用[1]。本研究利用30天喂養(yǎng)試驗評價該酒的亞急性毒性,為進一步開發(fā)利用該酒提供基礎(chǔ)。

1.3 指標檢測

1.3.1 血清學(xué)指標檢測

抽取大鼠尾靜脈，3000 rmp 離心10 min 后，用日立7020 型全自動生化分析儀進行檢測甘油三酯（tri?glycerides，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）和低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL），試劑盒均購自Roche公司。

1.3.2 熒光定量PCR檢測

取適量的組織，放入預(yù)冷的研缽中液氮研磨，用Trizol試劑提取總RNA，并將提取的RNA于－80℃保存待用。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara），將提取的總RNA在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后利用從NC?BI 數(shù)據(jù)庫中查找的目的基因的序列設(shè)計特異性引物（表1，引物均由上海生物工程有限公司合成），進行SYBR GREEN法熒光定量PCR實驗（Takara）。按照說明配置20 μL反應(yīng)體系，用兩步法進行RT-PCR 反應(yīng)，最后根據(jù)各反應(yīng)孔的Ct值，用相對定量2-△△ct法算出各目的基因的相對表達量。

表1 各目的基因的引物序列

1.3.3 Western blot檢測

預(yù)冷RIPA蛋白抽提試劑提取蛋白，提取時需加入蛋白酶抑制劑及磷酸酶抑制劑（Roche）。以組織重量（g）∶裂解液體積（mL）=1∶9的比例加入裂解液，電動組織勻漿器15000 rpm 轉(zhuǎn)速進行勻漿，每次10 s，間隔10 s，進行3 次勻漿。勻漿時EP 管需要浸入冰水混合物中進行降溫。勻漿完成后在冰上孵育20 min，4℃離心，13000 rpm，20 min。離心完成后取上清，分裝保存，提取的蛋白經(jīng)過BCA 法進行定量，并以RIPA 調(diào)整蛋白濃度，使加入5×還原樣品緩沖液后樣品終濃度為2 mg/ml，煮沸10 min 后進行SDS-PAGE 電泳。電泳使用5%濃縮膠，根據(jù)蛋白分子量大小使用8%～12%分離膠，先以90 V電壓電泳，待樣品進入分離膠后120 V電泳至低端，約1 h。電泳后用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，恒流300 mA 轉(zhuǎn)膜90 mim；5%脫脂牛奶-TBST（或2%BSA-TBST）封閉60 min，將膜與稀釋好的一抗4℃孵育過夜（所有一抗均為1∶1000稀釋，其中磷酸化IRE1 抗體的磷酸化位點為phospho S724，均購自abcam公司），次日TBST洗膜3次，每次10 min，洗去未結(jié)合的一抗，加二抗室溫孵育1 h（二抗為山羊抗兔IgG，1∶3000 稀釋，購自Abcam 公司），然后TBST 洗膜3次，每次10 min，洗去未結(jié)合的二抗，最后ECL 加到膜上后反應(yīng)2 min，化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀曝光拍照，使用ImageJ軟件獲取條帶的灰度值。將每個樣本的目的蛋白條帶與內(nèi)參（β-actin，1∶2000 稀釋，購自Abcam 公司）相比，得出目的條帶的相對表達量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)用SPSS統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，結(jié)果以均數(shù)± 標準差表示。采用ANOVA 檢驗，LSD 法進行兩兩比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肥胖大鼠模型建立

高脂飼料喂養(yǎng)12 周后，經(jīng)過體重的初步篩選，篩選出來的大鼠體重均值高于正常飼料喂養(yǎng)大鼠體重均值的22%，且Lee’s 指數(shù)顯著高于正常大鼠（P<0.01）。從血脂結(jié)果看，篩選出來的高脂喂養(yǎng)的大鼠總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）和低密度脂蛋白（LDL）均顯著高于正常大鼠，僅有高密度脂蛋白（HDL）未發(fā)現(xiàn)顯著性差異。綜上指標，本實驗肥胖模型構(gòu)建成功。

表2 肥胖大鼠與正常大鼠的指標比較

2.2 運動干預(yù)前后大鼠體重變化

2.3 不同運動干預(yù)方式對大鼠脂肪重量的影響

RE組和AE組的附睪和腹股溝脂肪重量均顯著低于C組（P<0.05）；RE和AE組的附睪和腹股溝脂肪重量均無顯著性差異（附睪脂肪：C vs. RE vs. AE：19.42± 2.47 g vs. 16.01 ± 2.41 g vs.15.08 ± 2.91 g；腹股溝脂肪：C vs. RE vs. AE：1.56 ± 0.27 g vs. 1.12 ±0.28 g vs.0.97 ± 0.20 g）（圖2）。

2.4 兩種運動方式對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因的影響

2.4.1 對GRP78、PERK、ATF6 和IRE1 的mRNA 的影響

8 周運動干預(yù)后，AE 組GRP78 的mRNA 水平在腹股溝脂肪和附睪脂肪中的相對表達量均顯著低于C組和RE 組（P<0.01，P<0.05），RE 組與C 組無顯著性差異（腹股溝脂肪：C vs. RE vs. AE：1.00 ± 0.20 vs. 1.08± 0.32 vs. 0.58 ± 0.18；附睪脂肪：C vs. RE vs. AE：1.00 ± 0.16 vs. 1.18 ± 0. 18 vs. 0.73 ± 0.13）。

圖1 8周運動干預(yù)對大鼠體重的影響

圖2 8周運動干預(yù)后各組附睪脂肪及腹股溝脂肪重量比較

RE 組PERK mRNA 在附睪脂肪中的相對表達量顯著高于C組（RE vs. C：1.34 ± 0.27 vs.1.00 ± 0.26，P<0.05），AE 組大鼠附睪脂肪和腹股溝脂肪中的PERK mRNA相對表達量與RE組和C組相比均無顯著性差異。

3 組大鼠附睪脂肪和腹股溝脂肪中ATF6 mRNA相對表達量均無顯著性差異。

AE組大鼠腹股溝和附睪脂肪中的IRE1 mRNA相對表達量顯著低于C 組和RE 組（P<0.01，P<0.05），RE組的IRE1 mRNA 在腹股溝脂肪中的相對表達量顯著高于C組（P<0.01），而在附睪脂肪中的相對表達量與C組無顯著性差異（腹股溝脂肪：C vs. RE vs. AE：1.00± 0.21 vs. 1.57 ± 0.31 vs. 0.44 ± 0.19；附睪脂肪：C vs. RE vs. AE：1.00 ± 0.32 vs. 1.15 ± 0. 18 vs.0.76 ± 0.11）（圖3）。

2.4.2 對GRP78和IRE1蛋白表達的影響

8周運動干預(yù)后，GRP78蛋白在AE組兩種脂肪中的相對表達量均顯著低于C 組和RE 組（P<0.01，P<0.05）（腹股溝脂肪：C vs. RE vs. AE：0.83 ± 0.15 vs.0.76 ± 0.17 vs. 0.36 ± 0.13；附睪脂肪：C vs. RE vs.AE：0.77 ± 0.20 vs. 0.68 ± 0.22 vs. 0.54 ± 0.12）；RE 組的GRP78 蛋白在兩種脂肪中的相對表達量C 組相比均無顯著性差異。IRE1蛋白磷酸化水平在AE 組腹股溝脂肪及附睪脂肪中顯著低于C 組和RE 組（P<0.01）；RE組在腹股溝脂肪中的蛋白磷酸化水平顯著高于C組（P<0.05），在附睪脂肪中的磷酸化水平與C組無顯著性差異（腹股溝脂肪：C vs. RE vs. AE：1.15 ±0.25 vs. 1.45 ± 0.47 vs. 0.58 ± 0.12；附睪脂肪：C vs. RE vs. AE：0.87 ± 0.26 vs. 1.07 ± 0.23 vs. 0.65± 0.16）（圖4）。

2.5 兩種運動對炎癥相關(guān)指標的影響

2.5.1 對IL-6和TNFα mRNA的影響

圖3 3組大鼠脂肪組織中的GRP78（A）、PERK（B）、ATF6（C）、IRE1（D）mRNA相對表達量

圖4 3組大鼠脂肪組織中GRP78（A）、IRE1（B）的蛋白表達量

8 周運動干預(yù)后，AE 組大鼠腹股溝脂肪和附睪脂肪中的IL-6 mRNA 相對表達量均顯著低于C 組和RE組（P<0.01），RE 組顯著高于C 組（P<0.01）（腹股溝脂肪：C vs. RE vs. AE：1.00 ± 0.24 vs. 3.32 ± 0.51 vs. 0.65 ± 0.26；附睪脂肪：C vs. RE vs. AE：1.00 ±0.22 vs. 1.85 ± 0.65 vs. 0.51 ± 0.12）。TNFα mRNA相對表達量在AE 組大鼠的兩種脂肪組織中均顯著低于C 組和RE 組（P<0.05），RE 組大鼠腹股溝脂肪中的TNFα mRNA相對表達量顯著高于C組（P<0.05）（腹股溝脂肪：C vs. RE vs. AE：1.00 ± 0.21 vs. 1.23 ±0.18 vs. 0.83 ± 0.23；附睪脂肪：C vs. RE vs. AE：1.00 ± 0.23 vs. 0.97 ± 0.20 vs. 0.79 ± 0.12）（圖5）。

圖5 3組大鼠脂肪組織中IL-6（A）及TNFα（B）的mRNA相對表達量

2.5.2 對IL-6和TNFα蛋白表達的影響

8 周運動干預(yù)后，AE 組的IL-6 蛋白在腹股溝脂肪和附睪脂肪中的相對表達量均顯著低于C 組和RE 組（P<0.01），RE 組的蛋白相對表達量顯著高于C 組（P<0.01）（腹股溝脂肪：C vs. RE vs. AE：0.28 ± 0.05 vs.0.45 ± 0.12 vs. 0.15 ± 0.04；附睪脂肪：C vs. RE vs.AE：0.29 ± 0.06 vs. 0.62 ± 0.10 vs. 0.18 ± 0.07）。TNFα蛋白在AE組大鼠的腹股溝脂肪中相對表達量顯著低于C組（P<0.05），與RE組無顯著性差異。在附睪脂肪中該蛋白的相對表達量3組間均無顯著性差異（腹股溝脂肪：C vs. RE vs. AE：0.53 ± 0.13 vs. 0.48 ± 0.09 vs.0.31 ± 0.07；附睪脂肪：C vs. RE vs. AE：0.33 ± 0.09 vs. 0.34 ± 0.12 vs. 0.33 ± 0.09）（圖6）。

圖6 運動干預(yù)后大鼠脂肪組織中IL-6（A）及TNFα（B）的蛋白表達變化

3 討論

研究已證實運動在減重減脂、改善胰島素抵抗、調(diào)節(jié)脂代謝等方面有重要作用，并且還可通過增加能量消耗改善肥胖狀態(tài)，并減輕肥胖所引起的代謝綜合征[22]。本研究8周的運動干預(yù)過程中，安靜對照組大鼠體重持續(xù)升高，而兩運動組大鼠體重基本平穩(wěn)或略有降低，干預(yù)完成后運動組體重顯著低于安靜對照組，且抗阻運動和有氧運動后的腹股溝脂肪和附睪脂肪都顯著減少，但二者無顯著性差異，這提示兩種運動方式均可有效降低肥胖大鼠的體重和脂肪重量。

研究表明，長期營養(yǎng)過剩會導(dǎo)致脂肪細胞ERS，進而導(dǎo)致糖尿病、非酒精性脂肪肝等多種代謝性疾病，合理的運動可改善脂肪細胞ERS，從而進一步改善脂代謝異常相關(guān)疾病[23，24]。

在Da 等[25]的研究中，游泳訓(xùn)練降低了高脂喂養(yǎng)大鼠肝臟和脂肪組織促炎癥因子，如c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）和B 細胞激活的核因子Κ輕鏈增強子（nuclear factor κ-light-chain-enhanc?er of activated B cells，NF-κB）的表達，同時下調(diào)了磷酸化的PERK 和真核細胞蛋白質(zhì)翻譯起始復(fù)合體2α（eukaryotic translation initiation factor 2α，eIF2α）的表達，從而減緩ERS。因此，運動很可能是通過降低肥胖大鼠ERS 從而下調(diào)炎癥信號，進而改善大鼠肥胖癥狀。但運動對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的作用也受多種因素影響[26]，運動對ERS的作用與運動強度有關(guān)，適宜的運動可以減緩ERS，使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)恢復(fù)穩(wěn)態(tài)，但若運動強度過高則會進一步加強ERS，最終引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)性死亡（En?doplasmic reticulum- associated degradation，ERAD）[23]。因此現(xiàn)有的研究結(jié)果并不統(tǒng)一。Bozi 等[27]的研究顯示，經(jīng)過8周的跑臺運動，大鼠心臟中的GRP78顯著降低，但Deldicque 等[28]在他們的研究中又發(fā)現(xiàn)，6 周的跑臺運動可以上調(diào)GRP78及PERK在小鼠肌肉及肝臟中的表達。還有研究發(fā)現(xiàn)，12 周的有氧運動和抗阻運動均沒能改變大鼠心臟中GRP78的表達量[29]。本研究中，有氧運動干預(yù)后皮下和內(nèi)臟脂肪中的GRP78 mRNA 和蛋白，IRE1 的mRNA 及蛋白磷酸化水平，IL-6、TNFα的mRNA及蛋白表達量都顯著降低，與上述大部分的研究結(jié)果較為一致。這說明本研究中的有氧運動方案能夠有效減緩肥胖大鼠脂肪組織的ERS 程度，且能夠顯著地改善肥胖大鼠脂肪組織的炎癥反應(yīng)。關(guān)于抗阻運動，Kim 等[30]的研究發(fā)現(xiàn)，8周的爬梯運動后，肥胖大鼠心臟的ERS相關(guān)指標明顯降低；Ziegler等[31]也發(fā)現(xiàn)，運動可以增加老年小鼠內(nèi)臟脂肪的抗炎表型。但在本研究中，8 周的抗阻運動干預(yù)結(jié)束后，雖然GRP78沒有出現(xiàn)顯著變化，但IRE1的mRNA 和蛋白磷酸化水平，以及促炎癥因子IL-6 的mRNA 和蛋白水平都出現(xiàn)較大幅度的提高，這說明本研究中的抗阻運動不僅未能改善ERS，反而加劇了脂肪組織中ERS 程度和炎癥反應(yīng)，這與前人的研究結(jié)果截然相反。對比上述兩個研究，在Kim的研究中，大鼠進行負重爬梯運動的負重方案為：爬梯運動的負重最開始為大鼠體重的30%～50%，然后在8 周的時間里逐漸增加至大鼠體重的100%；Ziegler的研究中，抗阻訓(xùn)練在10周時間內(nèi)，負重由5 g 增加到10 g，相當于體重的15%～30%。但在本研究中初始負重就是體重的50%，到訓(xùn)練的最后階段，負重已經(jīng)大大超過了大鼠體重。上述兩個研究的訓(xùn)練強度都明顯低于本研究的抗阻運動強度，因此，可能是由于本研究中抗阻運動方案中的運動強度過高，導(dǎo)致ERS 程度和炎癥反應(yīng)增加，但由于以上3 個研究中的研究組織并不一致，所以還不能確定是否是運動強度導(dǎo)致的相反結(jié)果，降低抗阻訓(xùn)練的訓(xùn)練強度會對ERS 程度和炎癥反應(yīng)有何種影響還需要進一步驗證。

4 結(jié)論

8 周有氧運動和抗阻運動均可有效減緩肥胖大鼠的體重增長，降低脂肪重量；相較于抗阻運動，有氧運動能更有效地降低脂肪組織IRE1蛋白的磷酸化水平，進而減輕其內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激程度和炎癥反應(yīng)。