王寧琦 包大鵬 龔麗景 晏冰 胡揚

1 北京體育大學（北京100084）

2 武漢體育學院健康科學學院，運動訓練監(jiān)控湖北省重點實驗室（武漢430079）

肌肉萎縮是高原適應過程中常見的一種肌肉功能障礙。目前已知，缺氧是高原肌肉萎縮的主要誘導因素。低氧可以通過抑制蛋白合成、加強蛋白分解等方式對骨骼肌的體積產生負面的影響。早期研究發(fā)現(xiàn)，適當?shù)捏w力活動可減緩高原暴露導致的肌肉萎縮[1，2]。近些年來有報道指出，在常壓低氧環(huán)境下進行抗阻練習能提高肌肉力量和體積[3，4]，但高原抗阻練習究竟通過怎樣的途徑對骨骼肌產生影響，尚未見相關人體實驗報道。目前，基因芯片技術已經廣泛應用于生物學和醫(yī)學領域的研究中，利用該技術我們可以同時觀測成千上萬個基因的表達，將研究視角從某個靶基因，或某條靶通路延伸到全基因表達水平，從而更加全面地探索機體的生理和病理變化，為治療和干預提供準確的靶目標。本研究采用基因芯片技術篩選高原抗阻訓練前后骨骼肌差異基因，并通過生物信息學手段篩選關鍵調控通路，旨在探討抗阻訓練對高原肌肉萎縮的干預機理，為該訓練手段在高原環(huán)境的應用提供理論基礎。

1 研究方法

1.1 研究對象

12 名男性大學生分為訓練組和對照組，每組各6人。受試者身體健康，無呼吸系統(tǒng)疾病及任何心肺功能疾病史，均為北方漢族平原居民，并在6個月內未到過高原或模擬高原環(huán)境中。受試者有抗阻練習經歷，但在實驗期間沒有參與其他規(guī)律性抗阻練習。實驗前受試者被詳細告知實驗流程并簽署知情同意書。受試者基本情況見表1。

表1 受試者基本情況（x ± s）

1.2 實驗設計

受試者暴露于海拔3700 米高原（拉薩）10 天。對照組每日進行基本的日?；顒樱柧毥M除此之外隔天進行抗阻練習。兩組的飲食和日常生活與平原保持一致?？棺杈毩暦桨赴凑誂CSM’S Guidelines for Exer?cise Testing and Prescription制定[5]。主要采用負重深蹲練習（75% 1RM）。輔助訓練采用負重屈小腿練習和負重拉杠鈴鍛煉股后肌群。每種練習進行5 組，每組重復10 次，組間間歇1 分鐘。整個訓練在教練指導下完成。

1.3 測試指標與方法

1.3.1 形態(tài)學指標測試

兩組受試者在高原暴露前后的常氧環(huán)境中進行測試。采用雙能X 線法測試體成分、大腿脂肪、瘦體重（雙能骨密度測試儀NOLAND）。采用Philips Achieva 3T 核磁共振成像系統(tǒng)（Philips Medical System）的SE（TR 500 ms，TE 20 ms ）序列掃描，連續(xù)掃描24 張片，層厚5 mm；矩陣560 × 560。以股骨大轉子為標志點向下20cm，選取大腿中部的一層進行分析。使用Matlab 圖像處理軟件（北京大學研發(fā)）對選取的圖片進行分割，計算大腿肌肉橫截面積（cross sectional area，CSA）。

1.3.2 取材

采用肌肉活檢技術，分別在高原暴露前后常氧環(huán)境下提取兩組受試者的股外側肌中部肌肉。高原暴露前一周禁止劇烈運動，高原暴露后返回平原即刻進行取材。具體步驟：碘酊擦拭活檢區(qū)域，然后用酒精擦拭活檢區(qū)域周邊；用鋪巾蓋住非手術區(qū)，暴露手術切口。注射利多卡因進行局部麻醉，待產生局麻效果后在手術區(qū)開1 cm小口，調試好活檢針插入傷口進行肌肉采集。將采集到的肌肉迅速放入生理鹽水中清洗，一部分放入RNA later 保存液而后置于4℃冰箱過夜后轉置于－20℃冰箱保存，用于芯片測試；另一部分放入凍存管后投入液氮，而后置于－80℃冰箱保存，用于RTqPCR檢測。

1.3.3 芯片分析

采用Agilent 全基因組表達譜芯片（SurePrint G3 Human Gene Expression）篩查高原暴露前后骨骼肌差異基因。由北京博奧晶典生物技術有限公司提供芯片雜交相關設備和技術支持。采用GeneSpring 軟件進行數(shù)據(jù)歸一化和差異表達分析篩出差異表達mRNA（Ab?solute Fold change≥1.5）?；贕ene ontology 數(shù)據(jù)庫進行基因功能（Gene ontology，GO）注釋，得到差異基因參與的所有生物學過程；基于KEGG數(shù)據(jù)庫，對差異基因進行Pathway注釋。

1.3.4 檢驗芯片

從差異基因所富集的顯著性通路中篩選差異基因進行熒光實時定量PCR（RT-qPCR）驗證。使用Prim?er5 軟件進行引物設計，使用NCBI-Blast 進行引物檢驗，引物由生工生物（上海）股份有限公司合成。目的基因和內參基因（RPS18）引物見表2。

配置RT-qPCR體系（見表3）。使用兩步法反應程序進行RT-qPCR反應（見表4）。

表2 RT-qPCR引物列表

表3 RT-qPCR體系

表4 RT-qPCR反應條件

1.3.5 所用數(shù)據(jù)庫及分析平臺

數(shù) 據(jù) 庫：（1）GenBank: http://www.nvbi.nlm.nih.gov ；（2）Gene Ontology annotaition: http://www.geneon?tology.org；（3）KEGG: http://www.genome，jp/kegg/；（4）BLAST: http://www.ncbi.nlm.nih.gov

分析平臺: （1）KOBAS（KEGG Orthology Based Annotation System）；（2）DAVID Bioinformatics Re?sources: https://david.ncifcrf.gov/

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法

形態(tài)學各項指標的數(shù)據(jù)以平均值±標準差（x±s）表示，每組自身前后變化采用配對樣本t檢驗。差異基因篩選采用獨立樣本t檢驗方法計算P值，采用Ben?jamini Hochberg FDR 方法對P值進行校正。RT-qP?CR數(shù)據(jù)分析采用△△Ct 值法。計算目標基因表達相較于相應對照組基因的改變倍數(shù)。使用獨立樣本t檢驗分析訓練組的芯片中差異基因mRNA變化值與RTqPCR 檢驗的差異基因mRNA 變化值是否具有顯著性差異，用于判斷芯片的有效性。P<0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 研究結果

2.1 實驗前后體重、瘦體重以及CSA的變化

實驗前后兩組體重均無顯著性變化。與實驗前相比，對照組全身和腿部瘦體重分別顯著下降1.86%和2.06%（P<0.05），訓練組全身和腿部瘦體重均無明顯變化。對照組CSA 顯著降低了3.3%（P<0.05），訓練組僅下降了2.46%，但未達到顯著性。見表5、表6。

2.2 實驗前后全身脂肪和下肢脂肪的變化

實驗前后，兩組的全身和下肢脂肪量無顯著性改變，見表7。

2.3 差異表達基因分析

通過1.5倍的差異基因篩選（P<0.05），訓練組差異基因共計432 個，其中上調192 個，下調240 個。對照組差異基因454個，其中上調199個，下調255個，聚類分析見圖1。

2.4 差異基因顯著性功能篩選和分析

GO注釋包括生物過程、細胞組成和分子功能三個部分。受高原缺氧環(huán)境的影響，對照組差異基因主要涉及的生物學過程有（P<0.01，F(xiàn)DR<0.01）：細胞周期、細胞生長、細胞增殖、激素反應、酶活性、氧化應激、蛋白質分解等。主要涉及的細胞組成包括紡錘體、無膜細胞器、細胞骨架、微管、收縮成分、肌原纖維等。分子功能主要涉及泛素蛋白酶活性、酶結合、泛素硫酯酶活性、蛋白激酶活性、胰島素受體結合和肌肉結構成分等。

圖1 兩組高原暴露前后差異基因聚類分析

表5 實驗前后體重和CSA的變化

表6 實驗前后瘦體重的變化

表7 實驗前后脂肪的變化

受高原缺氧和抗阻練習的雙重影響，訓練組差異基因主要涉及的生物過程有（P<0.01，F(xiàn)DR<0.01）：細胞周期、激素反應、肌肉生長、氧化應激以及蛋白代謝等過程。主要涉及的細胞組成包括紡錘體、受體復合體、細胞骨架、微管和無膜細胞器等。分子功能主要涉及酶結合、蛋白激酶結合、蛋白激酶活性和泛素硫酯酶活性等。

2.5 差異基因涉及的信號通路分析

結果顯示，對照組和訓練組分別有4 條和10 條調控通路具有統(tǒng)計學意義（P<0.05，校正P<0.05），見表8、表9。在訓練組中，與調控肌肉體積相關的通路有FOXO 信號通路（FOXO signaling pathway，hsa04068）、胰島素通路（Insulin signaling pathway，hsa04910）和ErbB 信號通路（ErbB signaling pathway，hsa04012）（見圖2、圖3、圖4）。此外，大多數(shù)通路與癌癥相關，如結腸癌（Colorectal cancer，hsa05210）、膀胱癌（Bladder cancer，hsa05219）等。

表8 對照組信號通路分析結果

表9 訓練組信號通路分析結果

（續(xù)表9）

圖2 FOXO信號通路

2.6 差異基因RT-PCR結果及訓練組芯片驗證結果

按照公式△ct=cttargct-ctreference計算△ct。結果顯示，訓練組的MYC（v-myc avian myelocytomatosis viral oncogene homolog）、CUL5（cullin 5）、STAT1（signal transducer and activator of transcription 1）、Jak3（Ja?nus kinase 3）、UBE4A（ubiquitination factor E4A）、ErbB3以及IGF-1（insulin like growth factor 1）基因在高原抗阻訓練后出現(xiàn)顯著變化（P<0.05），見表10。芯片驗證結果顯示，基因芯片和RT-qPCR分析結果較為一致，說明芯片檢測結果準確，見圖5。

圖3 胰島素信號通路

圖4 ErbB信號通路

表10 差異表達基因RT-qPCR結果

3 分析討論

3.1 短期高原抗阻練習對體重、體成分以及骨骼肌形態(tài)學指標的影響

早期研究表明，長期高原暴露能引發(fā)較為明顯的肌肉量丟失，并且伴隨肌肉力量的下降[6-8]。但也有研究認為，全身蛋白合成速率在高原暴露初期已開始下降，同時蛋白分解速率持續(xù)增加[9]。近些年來有研究發(fā)現(xiàn)[10]，7～9 天的高原暴露（4559 米）可導致蛋白分解增加并影響肌肉的蛋白調控過程。該研究認為低氧誘導mTOR（mechanistic target of rapamycin kinase）表達下降并抑制蛋白合成通路，導致肌肉量丟失。本研究發(fā)現(xiàn)，10天高原（海拔3700米）暴露可引起對照組體重和全身瘦體重的顯著性下降，并且下肢瘦體重的丟失更為明顯，同時伴有大腿肌肉橫截面積的減小。這與Holm 等[11]的研究結果相一致，他認為短期高原暴露即可導致全身性的蛋白分解。然而本研究中的訓練組在高原暴露前后未出現(xiàn)明顯的肌肉丟失。研究發(fā)現(xiàn)，高原停留期間從事適當?shù)捏w力活動（比如自行車，足球，籃球，攀巖等）可以維持肌肉體積[2]。Imoberdorf 等[1]等近一步證實了在高原上運動對蛋白合成的有利作用。運動對蛋白合成的刺激效應與肌肉收縮引發(fā)的促合成激素增加以及蛋白合成通路信號增強有關?？棺杈毩曌鳛橐豁椵o助性治療手段已廣泛應用于多種肌肉萎縮的治療[12，13]，它對肌肉的機械性刺激較強，能有效促進骨骼肌肥大并提高肌肉力量。本研究為了控制日常體力活動和飲食對本實驗的影響，對兩組在高原暴露期間的飲食和出行進行了統(tǒng)一安排。因此，本研究推測，高原暴露前后，訓練組的肌肉量及形態(tài)學指標未出現(xiàn)顯著性變化，可能是由于抗阻訓練激活了骨骼肌中蛋白質合成通路，從而削弱了缺氧對蛋白合成的抑制作用及促蛋白分解作用。這提示，高原暴露早期進行抗阻練習可在一定程度上減緩肌肉的丟失。

圖5 芯片驗證結果（以訓練組訓練后芯片結果為代表）

3.2 高原抗阻練習對骨骼肌基因表達的GO分析

為了進一步探究高原抗阻練習對骨骼肌作用的機理，本研究利用mRNA芯片掃描篩選差異基因，并采用GO 分析對差異基因的功能以及參與的生物學過程進行注解，結果顯示，對照組和訓練組的差異基因均參與了細胞周期、激素反應、細胞生長、氧化應激、磷酸化、泛素依賴性蛋白分解以及細胞內生物合成等相關過程。這說明高原缺氧對細胞的影響是廣泛的，不僅抑制細胞生長，還能促使機體氧化應激升高，從而引發(fā)多種有害的細胞效應[14]。此外，高原缺氧對機體的代謝過程也會產生很大影響，低氧對肌肉蛋白代謝的影響尤為明顯[15]，本研究結果與此較為一致。本研究結果顯示，對照組差異基因所富集的多個生物過程與蛋白分解相關，如GO:0030163 protein catabolic process、

GO:0051603 proteolysis involved in cellular protein catabolic process、GO:0044257 cellular protein catabol?ic process，說明高原暴露初期低氧誘導骨骼肌蛋白分解代謝加強可能是引發(fā)肌肉量丟失的主要原因。與對照組不同，在訓練組的GO 分析結果主要涉及蛋白修飾、信號轉導、胰島素受體、大分子生物合成以及細胞運動等生物過程?？梢酝茰y，高原抗阻練習可能抑制了某些與分解代謝相關的基因，因而可能在一定程度上緩解了低氧誘導的肌肉丟失。

3.3 高原抗阻練習對骨骼肌基因表達的信號通路分析

信號通路分析是通過Pathway 的主要公共數(shù)據(jù)庫KEGG 對差異基因進行分類。本研究將針對訓練組差異基因富集的與骨骼肌蛋白調控相關的主要信號通路進行分析。

3.3.1 高原抗阻練習對FOXO信號通路的影響

FOXO 是O 型叉頭轉錄因子家族，主要包括FOXO1、FOXO3、FOXO4 和FOXO6 等4 個轉錄因子[16]。FOXO家族主要參與多種重要的生物過程，如細胞周期停滯、DNA修復以及細胞凋亡[17]。其中FOXO1、FOXO3的表達與肌肉萎縮相關[18，19]。在FOXO 信號通路中，F(xiàn)OXO位于整個調控網絡的核心位置。本研究發(fā)現(xiàn)，高原暴露后對照組FOXO1基因有上調趨勢，而該基因在訓練組呈下調趨勢。FOXO1轉錄因子是胰島素通路下游Akt 蛋白的作用靶點，在促肌肉萎縮中起重要作用。動物實驗和細胞培養(yǎng)實驗均已證實FOXO1 的表達增加能降低骨骼肌細胞體積，因為它可以使誘導蛋白分解的相關基因MAFbx/atrogin-1（F-box protein 32）上調[20，21]。有研究發(fā)現(xiàn)，長期離心運動可使小鼠肌肉中FOXO1 的mRNA 表達顯著性下降，急性離心運動則上調該基因表達[22]，認為氧化應激對FOXO1 的表達有重要作用。當機體在低氧環(huán)境下暴露時會增加氧化應激效應，促使FOXO1表達增加。訓練組FOXO1基因表達下調可能與10天的抗阻練習有關，該訓練模式可能有利于機體對低氧的適應，從而降低低氧引發(fā)的氧化應激效應。

本研究結果表明，高原抗阻練習可以通過下調FOXO通路中的核心轉錄因子FOXO1基因的表達減緩骨骼肌內的蛋白分解過程，從而對高原暴露誘導的骨骼肌萎縮有抵抗作用。

3.3.2 高原抗阻練習對胰島素信號通路的影響

胰島素通路涉及多條分支，其中包括了葡萄糖轉運通路以及蛋白合成通路。低氧刺激對蛋白合成的負面影響已被大量報道證實[10]，低氧能夠從多個環(huán)節(jié)對蛋白合成通路產生抑制作用。一方面，在ATP 耗竭之后，低氧可以直接通過激活AMPK/PRKAA1（protein ki?nase AMP-activated catalytic subunit alpha 1）抑制mTOR 而不依賴于HIF-1α（hypoxia inducible factor 1 subunit alpha）[23]；另一方面，低氧也可通過TSC1/TSC2（TSC complex subunit 1/2）抑制mTOR[24]。本研究結果顯示，在胰島素通路中，INSR（insulin receptor）、IRS（in?sulin receptor substrate）、PI3K（phosphoinositide 3-ki?nase）以及Akt基因均下調。IRS是IGF-1受體底物，此基因是蛋白合成通路上游的重要基因，其下調可導致細胞對IGF-1 的敏感性下降，直接影響蛋白合成過程。PI3K 和Akt 基因是PI3K/Akt/mTOR 通路的重要成員，其表達下調可能對于蛋白合成有不利影響。不過，在芯片結果中發(fā)現(xiàn)IGF-1 基因上調，同時經RT-qPCR驗證也發(fā)現(xiàn)其顯著性升高。因而可以推斷，高原抗阻練習仍然可以有效增加IGF-1 的表達，但由于胰島素受體受低氧的影響，IGF-1的增加不能有效與受體進行結合，因此不能增強蛋白合成通路。而本研究中，10天高原抗阻練習不能對蛋白合成通路中的基因起上調作用可能與低氧對該通路的抑制作用有關。有報道指出，低氧對小鼠負重訓練后促肌肉肥大效應的影響是短暫的，只發(fā)生在低氧暴露的前12 天。之后，負重訓練的促蛋白合成效應將逐漸恢復而不受低氧的影響[25]。本研究的高原暴露時間僅為10 天，也即高原適應的初期，機體對低氧的反應較為強烈，因而可能會對抗阻練習后的促蛋白合成效應產生一定影響。另外，本研究的訓練強度是根據(jù)常氧環(huán)境下促肌肉肥大的訓練負荷制定的，受低氧的影響，該負荷可能不足以激活蛋白合成通路的基因，因而提示，今后可以嘗試通過增加訓練強度來增加其對肌肉的刺激程度，從而更深入地探索高原抗阻練習對蛋白合成通路的影響。

3.3.3 高原抗阻練習對ErbB信號通路的影響

NRG（neuregulin）/ErbB 通路在調節(jié)骨骼肌代謝中起重要作用[26]。神經調節(jié)蛋白NRG通過激活Ⅰ型受體酪氨酸激酶（RTKs）亞家族的三個受體ErbB2、ErbB3和ErbB4 發(fā)揮其調控作用[27]。在骨骼肌中，NRG作為調控神經肌肉接頭分化和生長的調節(jié)基因已被廣泛研究。其中，神經性和肌源性NRG 家族成員對肌管形成、肌肉的生長和分化有重要作用[28，29]。有研究發(fā)現(xiàn)，通過電刺激模式的抗阻訓練可激活NRG/ErbB通路，因而認為運動可通過NRG/ErbB 通路對骨骼肌代謝和增殖產生影響[30]。在本研究差異基因所富集的通路中也發(fā)現(xiàn)了ErbB通路，從該通路的調控圖中可以看出NRG/ErbB 中的NRG 和ErbB3 基因顯著性升高，而ErbB2 基因顯著性下調。不過，ErbB2 的下游靶分子SHC3（SHC adaptor protein 3）的基因表達升高，因而本研究認為，在高原環(huán)境下進行抗阻訓練同樣可以激活NRG/ErbB通路。有研究在去除神經的肌肉中發(fā)現(xiàn)，NRG以及ErbB3 表達增加伴隨葡萄糖轉運載體的增強，認為NRG/ErbB 有利于提高肌肉對葡萄糖的攝取。因此推測，高原抗阻練習可以通過NRG/ErbB通路影響骨骼肌的代謝過程，但其對肌肉質量的調控還有待于進一步研究。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，在ErbB 通路中，MAPK1/ERK2（mitogen-activated protein kinase 1）下游的靶基因MYC的表達也顯著性升高。有研究證明，ERK1/2通路可以通過調控核糖體RNA 的基因表達促進蛋白質的合成[31]，同時也受到IGF-1 的影響，對調控肌肉肥大效應有重要作用[32]。因而，MAPK1 的上調有利于促進肌肉的蛋白合成作用。MYC 是一種編碼絲氨酸/蘇氨酸的磷酸化蛋白質的原癌基因，不僅參與早期胚胎發(fā)生、細胞生長和分化過程，而且MYC 在細胞體積的調控中也發(fā)揮著重要作用[33，34]。研究發(fā)現(xiàn)，負重訓練后骨骼肌中MYC 蛋白表達增加對于衛(wèi)星細胞的增殖以及肌細胞的肥大性生長有重要作用[35]?？棺杈毩曀T導的肌肉肥大常伴隨較強的蛋白合成作用，滿足這一過程不僅需要激活核糖體復合物，同時還要有較高的蛋白翻譯水平，而提高蛋白翻譯水平需要增強核糖體RNA 的合成。MYC 能誘導多種核糖體蛋白轉錄水平的增加并提高蛋白合成作用。有研究發(fā)現(xiàn)，抗阻練習24小時后MYC的表達增加伴有核糖體RNA的增多，該研究認為，核糖體合成增強是影響運動后肌肉肥大的重要因素之一[36]。有研究顯示，小鼠在進行急性抗阻練習6 小時后MYC mRNA 水平顯著升高，并認為MYC mRNA 表達增加是肌肉肥大的早期反應[37]。因而，本研究推測，高原抗阻練習后MYC mRNA 表達增加可能對于維持肌肉質量有重要作用。

4 總結

高原抗阻練習對骨骼肌基因轉錄水平的影響是復雜的，涉及FOXO、ErbB以及胰島素等多條信號通路中相關基因的變化。一方面，低氧影響了抗阻練習對mTOR和MEK1/2/ERK等通路的激活作用，另一方面抗阻練習能削弱低氧對蛋白分解通路及相關基因如TSC2 和FOXO1 等的影響。本研究認為，高原暴露初期，雖然抗阻練習的促蛋白合成效應會受到低氧的影響，但仍然可以削弱低氧對肌肉蛋白的分解代謝作用，從而維持肌肉質量。不過，本研究僅從mRNA 轉錄水平上對該通路的差異基因進行分析，今后還應從蛋白水平上對以上所篩選出的通路進行深入研究。