李美 樓姣英 耿韋華 喬曉葉

清毒栓是金哲教授研究多年并在臨床上已取得較好療效的中成藥，臨床主要用于治療宮頸炎、宮頸人乳頭瘤病毒(Human Papilloma Virus，HPV)感染、宮頸上皮內(nèi)瘤變等，并取得了較滿意的療效[1-3]。前期課題研究發(fā)現(xiàn)清毒栓含藥血清對(duì)SiHa細(xì)胞體外增殖有明顯的抑制作用，可直接抑制SiHa細(xì)胞的生長、調(diào)節(jié)周期、促進(jìn)凋亡，可能通過對(duì)陰道局部免疫微環(huán)境的調(diào)節(jié)作用，起到抗病毒的作用[2]，并可能通過調(diào)控PTEN-Mdm2-p53網(wǎng)絡(luò)環(huán)路的分子機(jī)制，達(dá)到抑制腫瘤的目的[4-5]。本課題體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)中藥清毒栓灌胃處理可以顯著抑制宮頸癌荷瘤小鼠腫瘤細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡，且濃度越高,療效越顯著；清毒栓能夠上調(diào)干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)水平，降低轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β，TGF-β1)和白介素-10(interleukin- 10，IL-10)含量，可能逆轉(zhuǎn)微環(huán)境中的免疫抑制[6]，從而具有一定的抗病毒作用。體外研究發(fā)現(xiàn)清毒栓通過調(diào)節(jié)叉狀頭/翅膀狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子(Forkhead box P3,Foxp3)影響β-連環(huán)蛋白(β-catenin)通路從而抑制SiHa細(xì)胞的機(jī)制[7]。為進(jìn)一步探究機(jī)理，在前期基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)以人宮頸癌SiHa細(xì)胞為研究對(duì)象，觀察清毒栓含藥血清對(duì)SiHa細(xì)胞凋亡途徑相關(guān)基因及蛋白的表達(dá)影響，為該藥臨床應(yīng)用提供更充足的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及細(xì)胞株

清潔級(jí)C57BL/6小鼠22只，日齡49天，購自三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXX(鄂)，2017-0012。分籠飼養(yǎng)，溫度24～26℃，相對(duì)濕度50%～60%，通風(fēng)良好，每日光照12小時(shí)，晝夜交替；人宮頸癌SiHa細(xì)胞，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

清毒栓(專利號(hào)：ZL 201010109562.1)，主要組成為紫草、莪術(shù)、黃柏等，均購自北京同仁堂藥店，將復(fù)方藥物分別醇提(紫草)、油提(莪術(shù))、水煎(黃柏)，去渣后一副藥濃縮至20 mL，終濃度約為4.2 g/mL，高溫消毒后于4℃冰箱密封保存。

1.3 主要儀器

超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司，SW-CJ-1FD)；電熱恒溫水浴鍋(北京市長風(fēng)儀器儀表公司，HW-SY11-KP2)；凝膠掃描儀(Beckmancoulter，CytoFLEX)；流式細(xì)胞儀(BD Biosciences，F(xiàn)ACSCalibur)；PCR擴(kuò)增儀(北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司，EDC-810)；垂直電泳儀(北京六一儀器廠，DYCZ-24DN)；MultiskanMK3酶標(biāo)儀(Thermo，mμlISKANMK3)等。

1.4 主要試劑

磷酸緩沖鹽溶液、胎牛血清FBS(Gibco，16000-044)；改良Eagle培養(yǎng)基(Dulbecco’s modification of Eagle's medium,DMEM)(Gibco，11965118)；lip-2000(ThermoFisher，11668019)；含有苯甲基磺酰氟(Phenylmethylsulfonyl fluoride,PMSF)(南京沃宏，329-98-6)的裂解液(碧云天，P0013B)；樣品緩沖液(15 g SDS，15.6 mL 2 M Tris pH 6.8，57.5 g glycerol，16.6 mL β-mercaptoethanol)；聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜(Bio-Rad，162-0177)；GSK126；pGEM-Foxp3(北京義翹神州科技有限公，HG11652-G)；Foxp3抗體(1∶1000，Affinity，BF0630)、EZH2抗體(1∶1000，Affinity AF5150)、G1/S-特異性周期蛋白-D1抗體(1∶1000;Affinity，AF0931)、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(Caspase-3)抗體(1∶1000，Affinity，AF6311)、c-Myc抗體(1∶1000，Affinity，AF0358)、β-catenin抗體(1∶1000，Affinity，AF6266)；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗體(1∶2500，Abcam，AB9485)；辣根過氧化物酶二抗(Dianova，Hamburg，Germany)；電化學(xué)發(fā)光顯影液(Bio-Rad，170-5060)；八肽膽囊收縮素檢測(cè)試劑盒(cholecystokinin-8，CCK-8)(七海生物公司，20150520)；瓊脂糖凝膠(Biowest，111860)；染色質(zhì)免疫沉淀檢測(cè)試劑盒(Beyotime，P2078)。

1.5 含藥血清制備

將22只清潔級(jí)C57BL/6小鼠隨機(jī)分為空白組和藥物組，每組11只；分別用PBS和中藥對(duì)兩組小鼠進(jìn)行灌胃，早晚各1次，每次灌胃量為0.4 mL，連續(xù)灌胃3天；兩組小鼠均于最后1次給藥后1～2小時(shí)摘眼球取血；將血液靜置30分鐘后，3000 r/min，離心半徑14 cm，離心10分鐘，取上清分裝到1 mL無菌EP管中，保存至-80℃冰箱備用。用前56℃水浴30分鐘，滅活補(bǔ)體。

1.6 細(xì)胞培養(yǎng)

將SiHa細(xì)胞使用含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，視細(xì)胞生長情況用0.25%胰蛋白酶每周傳代2次。當(dāng)細(xì)胞穩(wěn)定并進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期時(shí)開始用于實(shí)驗(yàn)。

1.7 細(xì)胞分組及給藥方法

實(shí)驗(yàn)分為6組，EZH2抑制劑GSK126(10 μM)處理1小時(shí)后再進(jìn)行含藥血清或?qū)φ昭逄幚?，本研究設(shè)15%空白血清組，15%含藥血清組，15%空白血清+空白溶劑，15%空白血清+GSK126組，15%含藥血清+空白溶劑組，15%含藥血清+GSK126組。

1.8 染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)(Chromatin Immunoprecipitation, ChIP)+實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)法檢測(cè)Foxp3啟動(dòng)子區(qū)組蛋白甲基化水平

實(shí)驗(yàn)步驟：交聯(lián)→解交聯(lián)→超聲打碎→免疫沉淀→洗滌→DNA純化→PCR檢測(cè)。將長鏈的DNA打碎成不同長度的啟動(dòng)子引物序列。結(jié)果見表1。取5 μL的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加入2%瓊脂糖凝膠于凝膠掃描儀中電泳檢測(cè)含藥血清處理對(duì)Foxp3啟動(dòng)子區(qū)組蛋白甲基化水平影響。

表1 Fopx3啟動(dòng)子區(qū)引物序列信息

1.9 蛋白免疫印跡法(Western Blot，WB)檢測(cè)SiHa細(xì)胞EZH2的蛋白表達(dá)水平

分別用空白血清和15%含藥血清SiHa細(xì)胞進(jìn)行血清培養(yǎng)72小時(shí)，之后用含有PMSF的裂解液裂解后測(cè)定濃度，配膠完成鈉十二烷基的硫酸鹽聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)蛋白質(zhì)電泳，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用含0.1% Tween的4%牛奶封閉液，加入EZH2抗體和GAPDH抗體，4℃孵育過夜，洗膜、顯影、圖像進(jìn)行3次采集并分別計(jì)算目標(biāo)蛋白與內(nèi)參GAPDH灰度值的比值。

1.10 qRT-PCR法檢測(cè)SiHa細(xì)胞Foxp3 mRNA的表達(dá)水平

根據(jù)RNA提取試劑盒RNeasy MiniKit(Qiagen，74106)說明書提取RNA并對(duì)DNA酶DNase進(jìn)行消化(RNase-Free DNase Set，Qiagen，79254)。cDNA合成使用大容量cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Applied Biosystems，4368813)。按照使用手冊(cè)將預(yù)混SYBR Green I熒光染料的樣本用qRT-PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems，Step One Plus Real-Time PCR)進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。檢測(cè)Foxp3和的mRNA水平以GAPDH為對(duì)照，采用2-ΔΔct方法計(jì)算測(cè)定3次不同樣品中基因的相對(duì)表達(dá)量。反應(yīng)條件：qRT-PCR循環(huán)參數(shù)設(shè)定：95℃ 3分鐘，95℃ 30秒，62℃ 40秒，共40個(gè)循環(huán)。結(jié)果見表2。

表2 基因引物序列

1.11 WB法檢測(cè)SiHa細(xì)胞Foxp3蛋白以及Foxp3下游信號(hào)因子的表達(dá)水平

經(jīng)血清培養(yǎng)后，用WB法分別對(duì)15%空白血清+空白溶劑組，15%空白血清+GSK126組，15%含藥血清+空白溶劑組，15%含藥血清+GSK126組4組細(xì)胞中Foxp3蛋白及其下游信號(hào)分子β-catenin、c-Myc癌基因、細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(Caspase-3)蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別進(jìn)行3次檢測(cè)，具體檢測(cè)方法同上。

1.12 CCK-8檢測(cè)SiHa細(xì)胞的活性

取對(duì)數(shù)生長期SiHa細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化、離心、細(xì)胞計(jì)數(shù)后，調(diào)整細(xì)胞懸液密度為1×105個(gè)/mL，接種于規(guī)格為96孔的培養(yǎng)板內(nèi)(150 μL/孔)，24小時(shí)以后提取培養(yǎng)完成的貼壁細(xì)胞，在兩組EZH2抑制劑GSK126(10 μM)處理組及兩組空白溶劑組中的兩組細(xì)胞中再進(jìn)行含藥血清/對(duì)照血清處理。過表達(dá)質(zhì)粒組及兩組空白質(zhì)粒組中以150 μL/孔分別加入含藥血清和空白血清，各組設(shè)5復(fù)孔。將培養(yǎng)板置于5% CO2培養(yǎng)箱中孵育72小時(shí)后，每孔加入10 μL CCK-8試劑，混勻，采用Multiskan MK3酶標(biāo)儀在450 nm雙波長處分別測(cè)得3次相應(yīng)的吸光值(OD值)。

1.13 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 ChIP檢測(cè)Foxp3蛋白啟動(dòng)子組蛋白甲基化水平

Foxp3啟動(dòng)子-370—-520區(qū)域檢測(cè)出甲基化條帶，15%含藥血清組與空白血清組相比，該區(qū)域甲基化條帶明顯增寬。結(jié)果見圖1。

圖1 清毒栓含藥血清對(duì)Foxp3啟動(dòng)子不同序列區(qū)組蛋白甲基化水平影響

引物1對(duì)應(yīng)Foxp3-200—-350啟動(dòng)子區(qū)域，引物2對(duì)應(yīng)Foxp3-370—-520啟動(dòng)子區(qū)域，引物3對(duì)應(yīng)Foxp3-700—-850啟動(dòng)子區(qū)域，引物4對(duì)應(yīng)Foxp3-900—-1050啟動(dòng)子區(qū)域。結(jié)果見圖2。

圖2 清毒栓含藥血清對(duì)Foxp3啟動(dòng)子組蛋白甲基化影響

2.2 WB法檢測(cè)兩組細(xì)胞中的EZH2表達(dá)

15%含藥血清組與空白血清組相比，SiHa細(xì)胞中EZH2蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著增加(P<0.05)。見圖3、表3。

注：A：15%空白血清組；B：15%含藥血清組。

表3 WB法檢測(cè)清毒栓含藥血清對(duì)SiHa細(xì)胞EZH2蛋白表達(dá)的影響

2.3 CCK-8法檢測(cè)SiHa細(xì)胞的活性

為了說明含藥血清誘導(dǎo)的Foxp3表達(dá)下調(diào)與EZH2有關(guān)，采用EZH2抑制劑GSK126，研究其對(duì)SiHa細(xì)胞凋亡的影響。GSK126造模時(shí)間72小時(shí)，測(cè)OD值。結(jié)果顯示：15%空白血清+GSK126組與15%空白血清+空白溶劑組相、15%含藥血清+GSK126組與15%含藥血清+空白溶劑組，OD值顯著升高(P<0.05)；15%含藥血清+空白溶劑組與15%空白血清+空白溶劑組、15%含藥血清+GSK126組與15%空白血清+GSK126組相比，OD值顯著降低(P<0.05)。見表4。

表4 CCK-8檢測(cè)各處理組SiHa細(xì)胞活性

2.4 qRT-PCR檢測(cè)Foxp3的mRNA的表達(dá)水平

分別用15%含藥血清處理后，mRNA表達(dá)含量明顯降低(P<0.05)；GSK126處理后，表達(dá)含量明顯升高(P<0.05)。且EZH2抑制劑GSK126可以逆轉(zhuǎn)含藥血清誘導(dǎo)的Foxp3的mRNA表達(dá)降低(P<0.05)。見表5。

表5 WB法檢測(cè)各組SiHa細(xì)胞Foxp3蛋白相對(duì)表達(dá)含量

2.5 WB法檢測(cè)SiHa細(xì)胞Foxp3蛋白以及Foxp3下游信號(hào)因子的相對(duì)表達(dá)量

分別用15%含藥血清處理后，蛋白表達(dá)含量明顯降低(P<0.05)；GSK126處理后，蛋白含量明顯升高(P<0.05)。且EZH2抑制劑GSK126可以逆轉(zhuǎn)含藥血清誘導(dǎo)的Foxp3蛋白的表達(dá)降低(P<0.05)。見圖4、表6。

表6 qRT-PCR法檢測(cè)各組SiHa細(xì)胞Foxp3 mRNA相對(duì)表達(dá)含量

分別用15%含藥血清和GSK126處理Control-15%+solvent組，含藥血清處理后，β-catenin、Cyclin D1、c-Myc蛋白含量顯著降低(P<0.05)，Caspase-3蛋白含量顯著增加(P<0.05)；GSK126處理后，β-catenin、Cyclin D1、c-Myc蛋白含量顯著增加(P<0.05)，Caspase-3蛋白含量顯著降低(P<0.05)。EZH2抑制劑GSK126可以逆轉(zhuǎn)含藥血清誘導(dǎo)的β-catenin、Cyclin D1、c-Myc蛋白含量降低及Caspase3蛋白含量增加。見圖5、表7。

注：C：15%空白血清+空白溶劑組；D：15%空白血清+GSK126組；E：15%含藥血清+空白溶劑組；F：15%含藥血清+GSK126組。

注：(1)C：15%空白血清+空白溶劑組；D：15%空白血清+GSK126組；E：15%含藥血清+空白溶劑組；F：15%含藥血清+GSK126組。

表7 WB法檢測(cè)各組SiHa細(xì)胞Foxp3下游信號(hào)因子相對(duì)表達(dá)含量

3 討論

宮頸癌是導(dǎo)致全球女性死亡的第二大惡性腫瘤[8]，僅次于乳腺癌，發(fā)病率在我國女性生殖道惡性腫瘤中居第一位。臨床研究表明，持續(xù)的HPV感染是宮頸癌發(fā)生的必要因素，此外，宿主細(xì)胞基因的遺傳和表觀遺傳學(xué)改變對(duì)于宮頸癌前病變向浸潤性癌癥的發(fā)展至關(guān)重要。根據(jù)致病危險(xiǎn)性不同，HPV分為高危型和低危型，高危型HPV16、18型是最主要的兩種致癌性HPV，分別占宮頸癌發(fā)病的55%～60%、10%～15%，其他類型的HPV感染有地域性差異[9-10]。HPV主要通過感染皮膚和宮頸鱗狀細(xì)胞的基底細(xì)胞產(chǎn)生損傷，其中大多數(shù)女性體內(nèi)的HPV會(huì)被自身免疫系統(tǒng)清除，并不產(chǎn)生病變，而一部分女性體內(nèi)的HPV會(huì)產(chǎn)生持續(xù)性感染，若不予以及時(shí)干預(yù)，HPV將以環(huán)狀DNA方式自我復(fù)制，隨著病情進(jìn)展整合到宿主細(xì)胞DNA中，造成宿主細(xì)胞異常分化引發(fā)癌變。所以機(jī)體免疫力，尤其是宮頸局部免疫微環(huán)境對(duì)HPV的清除至關(guān)重要。表觀遺傳學(xué)改變是指在核苷酸序列不發(fā)生改變的情況下，基因表達(dá)發(fā)生可遺傳的變化。DNA甲基化是目前研究最清楚且最重要的表觀遺傳修飾形式，HPV基因甲基化改變及其對(duì)宿主DNA甲基化的影響，在宿主細(xì)胞癌變過程中發(fā)揮重要作用。局部免疫微環(huán)境中的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory Tcells，Treg)是具有免疫調(diào)節(jié)作用的T細(xì)胞亞群，具有免疫低反應(yīng)及免疫抑制作用，在宮頸局部免疫微環(huán)境中維持著機(jī)體免疫耐受和免疫穩(wěn)態(tài)的作用。Foxp3作為天然Treg的可靠標(biāo)記物[11]，是Treg細(xì)胞的重要轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)維持其免疫抑制起決定性作用。Foxp3在不同癌癥中扮演著不同角色，如在乳腺癌、前列腺癌、胃癌中扮演著抑癌基因角色，而在胰腺癌及非小細(xì)胞肺癌中起著促癌作用[12]；EZH2是一種較為常見的組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶，是癌癥的重要表觀遺傳調(diào)控因子，可以通過調(diào)控組蛋白H3K27三甲基化(H3K27me3)，從而抑制Foxp3轉(zhuǎn)錄表達(dá)[13]，最終影響Treg細(xì)胞分化和功能維持。本課題組前期研究結(jié)果顯示，F(xiàn)oxp3在宮頸癌SiHa細(xì)胞中扮演原癌基因的角色。但是否與EZH2有關(guān)，具體通過何種途徑抑制SiHa細(xì)胞活性，需要深入基因表觀遺傳學(xué)及分子信號(hào)通路方面。本研究以宮頸癌SiHa細(xì)胞為研究對(duì)象，探討清毒栓含藥血清通過對(duì)SiHa細(xì)胞中EZH2及Foxp3表達(dá)的影響進(jìn)而調(diào)控β-catenin信號(hào)通路，最終抑制宮頸SiHa細(xì)胞活性的機(jī)制，進(jìn)一步闡明清毒栓作用的分子機(jī)制，為臨床治療宮頸HPV感染提供理論依據(jù)。

近年來，腫瘤的局部免疫環(huán)境成為腫瘤研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤的早期，機(jī)體的全身免疫功能并未出現(xiàn)明顯的改變,但是腫瘤局部即已存在免疫抑制，而宮頸HR-HPV感染以及宮頸癌的發(fā)生與宮頸局部免疫微環(huán)境有著密切的關(guān)系。局部免疫微環(huán)境中Treg細(xì)胞是具有免疫調(diào)節(jié)作用的T細(xì)胞亞群，在腫瘤局部免疫反應(yīng)中起決定性作用。Foxp3作為Treg重要的轉(zhuǎn)錄因子，是Treg細(xì)胞的重要標(biāo)記物，對(duì)Treg細(xì)胞的分化和免疫抑制功能起決定性作用[14-15]。研究發(fā)現(xiàn)Foxp3在宮頸癌組織中表達(dá)升高，并與腫瘤的分期及生物學(xué)行為密切相關(guān)，由此可作為宮頸癌的篩查、術(shù)前疾病評(píng)估和術(shù)后隨訪的輔助指標(biāo), 也為臨床靶向干預(yù)提供了理論依據(jù)[16]。腫瘤細(xì)胞表達(dá)的Foxp3促進(jìn)腫瘤免疫逃逸，F(xiàn)oxp3可能通過非Treg細(xì)胞依賴的其他機(jī)制來影響腫瘤免疫微環(huán)境，進(jìn)而促成腫瘤的免疫逃逸[15,17],臨床研究發(fā)現(xiàn)，去除癌癥患者CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞可提高宿主局部免疫功能并對(duì)抗腫瘤起一定積極作用[18]。啟動(dòng)子甲基化以及相關(guān)的組蛋白修飾的改變能夠影響染色質(zhì)構(gòu)象和組織特異性基因表達(dá)的表觀遺傳學(xué)修飾[19]，F(xiàn)oxp3啟動(dòng)子區(qū)組蛋白甲基化修飾等表觀遺傳調(diào)控對(duì)于控制Treg細(xì)胞基因特別是Foxp3基因的表達(dá)起到很關(guān)鍵的作用，DNA甲基化是最常見的表觀遺傳修飾形式，DNA高甲基化與基因沉默相關(guān)聯(lián)，而去甲基化則與基因表達(dá)活性增加有關(guān)[20]。所以Foxp3啟動(dòng)子區(qū)組蛋白甲基化水平升高可能抑制其轉(zhuǎn)錄水平，降低Foxp3的表達(dá)。

Foxp3基因的表達(dá)調(diào)控中組蛋白H3K27的甲基化修飾起到重要作用。目前已知組蛋白H3K27的甲基化修飾受Polycomb基因家族蛋白復(fù)合體調(diào)控。Polycomb基因家族主要包括以mi1-Ring1b為核心組分的PRC1復(fù)合體以及以EZH2為核心組分的PRC2復(fù)合體。EZH2是含有保守SET功能區(qū)域的組蛋白甲基化酶，在PRC2蛋白復(fù)合體中起甲基酶活性催化作用。許多研究證實(shí)PRC1以及PRC2介導(dǎo)的H3K27甲基化修飾在癌癥發(fā)生中起至關(guān)重要的作用?？衫肊ZH2組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶活性將H3H27三甲基化，從而抑制靶基因轉(zhuǎn)錄,并參與調(diào)控細(xì)胞周期、細(xì)胞衰老、細(xì)胞分化等生理或病理過程[21]。Xie等[22]認(rèn)為EZH2抑制劑逆轉(zhuǎn)了H3K27me3的上調(diào)?？梢奅ZH2是一種甲基轉(zhuǎn)移酶，可以促進(jìn)組蛋白甲基化。與不同的蛋白結(jié)合以及不同的細(xì)胞背景下，EZH2可以扮演抑制基因的角色，也可以活化基因表達(dá)[23]。雖然EZH2在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增值、擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移的惡性表現(xiàn)，但有學(xué)者認(rèn)為EZH2在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制復(fù)雜、具有雙面性，而且在不同腫瘤細(xì)胞類型中作用不同[24]。Cardenas等[25]研究發(fā)現(xiàn)卵巢癌細(xì)胞中的EZH2通過維持E盒結(jié)合鋅指蛋白(ZEB)2基因啟動(dòng)子區(qū)組蛋白H3K27三甲基化而抑制其表達(dá)，進(jìn)而抑制卵巢癌細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、阻滯腫瘤遷移發(fā)生。

β-catenin是β-catenin信號(hào)通路的重要組成部分，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的浸潤以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，從而加速腫瘤細(xì)胞的惡化[26]。研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌、食管癌、結(jié)直腸癌等多臟器組織癌變中，均存在β-catenin異常表達(dá)。C-Myc屬原癌基因，在Wnt/β-catenin細(xì)胞信號(hào)通路中發(fā)揮著重要作用，影響著細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及細(xì)胞周期的進(jìn)程[27]。研究發(fā)現(xiàn)c-Myc的高表達(dá)可能促進(jìn)宮頸癌的侵襲及轉(zhuǎn)移[28]。Cyclin D1是細(xì)胞周期中與惡性腫瘤關(guān)系最為密切的癌基因之一，其高表達(dá)不僅能加速細(xì)胞增生分化，與腫瘤發(fā)生、進(jìn)展有密切關(guān)系，還能經(jīng)由調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄程序致使染色體不穩(wěn)定及腫瘤發(fā)生[29]。半胱氨酸蛋白酶(Caspases)家族是直接導(dǎo)致凋亡細(xì)胞解體的蛋白酶系統(tǒng)，Caspase-3是細(xì)胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶，當(dāng)非活性的pro-Caspase-3被剪切后，產(chǎn)生活性的cleaved-Caspase-3，從而發(fā)揮催化酶的作用，在細(xì)胞凋亡過程中占據(jù)重要地位[30]。

本實(shí)驗(yàn)采用ChIP檢測(cè)技術(shù)對(duì)Foxp3啟動(dòng)子區(qū)的組蛋白修飾進(jìn)行分析定位，從而研究組蛋白的各種共價(jià)修飾與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的關(guān)系，qRT-PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)了在Foxp3啟動(dòng)子上找到轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的直接證據(jù)。用Western Blot檢測(cè)含藥血清培養(yǎng)的SiHa細(xì)胞和空白血清培養(yǎng)的SiHa細(xì)胞中的EZH2含量，在兩組基礎(chǔ)上分別設(shè)置含藥血清加抑制劑組和空白血清加抑制劑組，用CCK-8法檢測(cè)四組細(xì)胞的活性。表明含藥血清能增加EZH2的表達(dá)，含藥血清組與其對(duì)照組相比，含藥血清加抑制劑組與空白血清加抑制劑組相比，F(xiàn)oxp3表達(dá)顯著降低，SiHa細(xì)胞活性下降，表明含藥血清抑制Foxp3的表達(dá)，抑制SiHa細(xì)胞的活性；空白血清加抑制劑組與空白血清組相比，含藥血清加抑制劑組與含藥血清組相比，F(xiàn)oxp3表達(dá)顯著增加，SiHa細(xì)胞活性升高，表明EZH2抑制劑GSK126能夠逆轉(zhuǎn)含藥血清誘導(dǎo)的Foxp3表達(dá)降低及SiHa細(xì)胞活性下降。含藥血清組與空白血清組相比，下游信號(hào)因子含量顯著降低，并促進(jìn)Caspase-3剪切，表明含藥血清抑制β-catenin通路；空白血清加抑制劑組與空白血清組相比，含藥血清抑制劑組與含藥血清組相比，下游信號(hào)因子表達(dá)顯著增加，并抑制Caspase-3剪切，表明EZH2能逆轉(zhuǎn)含藥血清誘導(dǎo)的β-catenin通路抑制。含藥血清抑制劑組與空白血清加抑制劑組相比，Cyclin D1蛋白含量變化無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明含藥血清可能是通過EZH2調(diào)節(jié)Cyclin D1蛋白的表達(dá)。

綜上所述，清毒栓提取物通過促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞中EZH2表達(dá)，增加Foxp3啟動(dòng)子組蛋白甲基化水平從而抑制Foxp3表達(dá)，影響下游因子表達(dá)，最終抑制SiHa細(xì)胞活性。本研究進(jìn)一步闡明清毒栓提取物通過調(diào)節(jié)EZH2抑制SiHa細(xì)胞活性的機(jī)制，為清毒栓治療宮頸HPV感染提供理論依據(jù)，也為更多的宮頸癌藥物研發(fā)提供一定的思路。但本實(shí)驗(yàn)不能完全解釋清毒栓影響Foxp3表觀遺傳調(diào)控分子的精準(zhǔn)機(jī)制，進(jìn)一步結(jié)合慢病毒介導(dǎo)的敲降和過表達(dá)技術(shù)，研究Foxp3相關(guān)的H3K27甲基化修飾在人類子宮頸癌細(xì)胞中的作用和機(jī)制將會(huì)對(duì)宮頸癌的治療提供有效的治療方法。