王利民 鞏瑞 吳俊琪

類風濕性關節(jié)炎（rheumatoid arthritis,RA）是一種病因不明、以慢性炎性滑膜炎為主的系統(tǒng)性自身免疫性疾病，其特征是手、足小關節(jié)的多關節(jié)、對稱性、侵襲性關節(jié)炎癥，常伴有肺部、腎臟、心血管系統(tǒng)等關節(jié)外表現(xiàn)及伴發(fā)其他自身免疫病的重疊綜合征。RA可發(fā)生于所有年齡段，男女比例1∶4[1]。2010年美國風濕病協(xié)會提出的RA分類標準，把抗瓜氨酸蛋白抗體（ACPAs）列入血清學檢測指標。與類風濕因子（RF）相比，抗環(huán)瓜氨酸多肽抗體（CCP）診斷RA靈敏度和特異度更高，已被臨床廣泛應用。而關于抗核周因子抗體（APF）診斷RA價值的研究，目前多集中于診斷的靈敏度和特異度以及與疾病活動性的關系。本研究比較了抗APF、抗角蛋白抗體（AKA）、抗CCP、RF在RA患者中陽性率的差異，探討上述自身抗體在RA診斷中的價值以及抗APF與RA病程、關節(jié)外表現(xiàn)和重疊綜合征的相關性，現(xiàn)將結果報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 收集2019年3至12月浙江大學醫(yī)學院附屬金華醫(yī)院就診的RA患者257例，男51例，女206例，年齡 11～85（58.22±11.61）歲；病程 0.1～40 年，中位病程 8（3，15）年；平均 28 關節(jié)疾病活動性指數(shù)（DAS28）為 3.52±1.18；中位 CRP 水平為 9.4（1.25，23.60）mg/L；平均骨密度（BMD）為-1.68±1.16；均符合美國風濕病學會（American College of Rheumatology,ACR）1987年推薦的RA分類診斷標準[2]。非RA自身免疫患者217例，男 72例，女 145例，平均年齡（46.24±13.38）歲，包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡（rheumatoid arthritis,SLE）42例，強直性脊柱炎（ankylosing spondylitis,AS）89例，干燥綜合征（Sjogren's syndrome,SS）72例，系統(tǒng)性硬化癥（systemic sclerosis,SSc）14例，診斷均符合相應的國際分類診斷標準[3-6]；選取同期本院健康體檢中心的健康體檢者40例，男 18例，女 22例，平均年齡（39.50±14.19）歲。3組間性別、年齡比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。本研究經(jīng)本院醫(yī)學倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 試劑 抗角蛋白抗體（AKA）間接免疫熒光法檢測試劑盒（德國歐蒙醫(yī)學實驗診斷股份公司）；抗APF間接免疫熒光法檢測試劑盒（北京和杰創(chuàng)新生物醫(yī)學科技有限公司）；抗CCP化學發(fā)光法檢測試劑盒和儀器i-Flash 3000（深圳亞輝龍生物科技股份有限公司）；RF速率散射比濁法檢測試劑盒和儀器西門子BNⅡ（德國西門子生物科技有限公司）。

1.3 方法 采集清晨空腹靜脈血4 ml，室溫凝集1 h后，4℃1 500 g離心5 min分離血清，將血清分裝并凍存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1 抗AKA檢測 采用間接免疫熒光法（IIF）檢測。血清1∶10稀釋后，加25 μl稀釋血清至抗原基質片反應區(qū)，室溫孵育反應30 min，洗滌液沖洗后在PBS緩沖液中浸泡5 min，加入20 μl FITC標記的抗人球蛋白，避光室溫孵育30 min，流水沖洗在PBS緩沖液中浸泡5 min，滴加甘油介質至蓋玻片，封片后在熒光顯微鏡下觀察結果。抗體滴度＞1∶10為陽性。

1.3.2 抗APF檢測 采用IIF檢測。血清1∶20稀釋后，加25 μl稀釋血清至抗原基質片反應區(qū)，室溫孵育反應30 min，洗滌液沖洗后在PBS緩沖液中浸泡5 min，加入25 μl FITC標記的兔抗人球蛋白，避光室溫孵育30 min，洗滌液沖洗后在PBS緩沖液中浸泡5 min，滴加甘油介質至蓋玻片，封片后在熒光顯微鏡下觀察結果。同一反應孔陽性細胞＞5個為抗APF陽性，＜5個為可疑，少于2個為陰性。

1.3.3 抗CCP和RF檢測 采用化學發(fā)光法檢測抗CCP，抗 CCP＞5.0 U/ml為陽性，線性范圍 0.5～200 U/ml，＞200 U/ml按200 U/ml計算。采用速率散射比濁法檢測 RF，RF＞15.0 U/ml為陽性。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件。正態(tài)分布的計量資料以表示，非正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)（四分位數(shù)間距）表示?？笰PF、抗AKA、抗CCP和RF陽性率的比較采用χ2檢驗；抗APF與晨僵、病程、CRP、BMD、DAS28的相關性分析采用Spearman秩相關；抗體診斷價值采用ROC曲線分析，以約登指數(shù)最大值確定最佳臨界值，獲得AUC、靈敏度、特異度。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 257例RA患者4種自身抗體陽性率的比較 抗APF的陽性率高于抗AKA，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），低于抗CCP和RF的陽性率，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 257例RA患者4種自身抗體陽性率的比較[例（%）]

2.2 4種自身抗體在RA中的診斷價值 以確診RA為陽性病例，以非RA組和健康體檢者為陰性病例，使用ROC曲線，AUC值，靈敏度、特異度評價抗APF、抗CCP、RF和抗AKA對RA的診斷價值。在最佳臨界值時，抗APF診斷靈敏度為87.2%高于抗CCP抗體的81.3%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），高于RF的85.6%差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖1和表3。

圖1 4種自身抗體診斷類風濕關節(jié)炎（RA）的ROC曲線

表3 抗APF，抗CCP，RF和抗AKA對RA的診斷效能

2.3 抗 APF 與晨僵、RA 的病程、CRP、BMD、DAS28、抗CCP、抗AKA、RF之間的相關性 平均抗APF為（4.67±2.35）個/孔，抗 CCP 為（102.18±84.72）U/ml，抗 AKA 稀釋倍數(shù)為 1：16.94±7.44，RF 為 84.6（25.1,345.5）U/ml；抗APF陽性患者中有晨僵85例，無晨僵25例，陰性患者中有晨僵96例，無晨僵51例；抗APF與RA病程、抗AKA、有無晨僵均呈正相關（均 P＜0.05），與 CRP、抗CCP、RF均呈負相關（均 P＜0.05），與 BMD 和 DAS28不相關（均 P＞0.05），見表 4。

表4 抗APF與RA病程、抗CRP、BMD、DAS28之間的相關性

2.4 4種自身抗體與關節(jié)外表現(xiàn)和重疊綜合征之間的關系 257例RA患者中，有16例（6.23%）同時伴發(fā)有其他自身免疫性疾病（包括SS 7例，結締組織病3例，系統(tǒng)性紅斑狼瘡2例，自身免疫性肝病3例，多發(fā)性肌炎1例）的重疊綜合征，156例（60.7%）伴有關節(jié)外表現(xiàn)，其中肺部受累42例（16.34%），血液系統(tǒng)受累100例（38.91%），腎臟受累 4例（1.56%）。抗 APF、抗 CCP、抗AKA和RF與重疊綜合征無統(tǒng)計學差異（χ2=0.006、0.023、0.299、0.072，均 P＞0.05）；抗 APF和抗 CCP與關節(jié)外表現(xiàn)差異有統(tǒng)計學意義（χ2=6.972、9.245，均 P＜0.05），抗AKA、RF與關節(jié)外表現(xiàn)差異無統(tǒng)計學意義（χ2=3.601、0.024，均 P＞0.05）。見表 5。

表5 4種自身抗體與關節(jié)外表現(xiàn)和重疊綜合征之間的關系（例）

3 討論

RA是系統(tǒng)性自身免疫病中常見的一類疾病，目前大部分實驗室對ACPA家族中抗CCP和RF應用較多，然而仍有很大一部分疑診人群RF和抗CCP均為陰性，抗APF的檢測可以補充RA血清學診斷的不足，本研究對RA患者分析證實了抗APF在疾病診斷中的應用價值。抗APF在257例RA中的陽性率為42.80%，低于RF和抗CCP，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），與Cassani等[7]報道抗APF在90例RA患者中陽性率為82%不一致，可能為人種或者選取患者有關。與孫佳穎等[8]報道的抗APF在196例RA患者中的陽性率44.39%相近。4項聯(lián)合抗APF/抗CCP/RF/抗AKA和3項聯(lián)合抗APF/抗CCP/RF的陽性率均為94.16%，高于抗CCP的79.77%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），與孫佳穎等[8]報道一致。本研究發(fā)現(xiàn)抗APF最佳臨界值為2.5時，診斷靈敏度（87%）高于抗 CCP和 RF，特異度低于抗CCP，與Cassani等[7]報道抗APF在90例RA患者中靈敏度為82%一致，ROC曲線計算值與說明書給定的閾值不同情況，可能因素為單中心研究人群的選擇性偏移等造成。

Gonzalez-Lopez等[9]報道235例RA患者（有關節(jié)外表現(xiàn)95例，無關節(jié)外表現(xiàn)130例），患者年齡高、長病程、高DAS28評分與關節(jié)外表現(xiàn)相關，抗CCP、RF與關節(jié)外表現(xiàn)無相關性，本研究發(fā)現(xiàn)抗APF和抗CCP與RA關節(jié)外表現(xiàn)有統(tǒng)計學差異，RF和抗AKA與關節(jié)外表現(xiàn)差異無統(tǒng)計學意義，與Gonzalez得出的結論不同。有關RA重疊綜合征相關文獻報道多為個案報道，其中最多見的是Rhupus綜合征、RA合并SS或RA合并SSc等[10-12]。本研究發(fā)現(xiàn)抗APF、抗CCP、RF和抗AKA與RA重疊綜合征差異無統(tǒng)計學意義；APF與RA的疾病活動度不相關，與Abedian Zeinab等[13]報道不一致。本研究還發(fā)現(xiàn)抗APF與RA的活動指標CRP呈負相關，而與DAS28不相關，有待進一步研究。

綜上所述，本研究通過分析4種自身抗體在RA診斷中的應用價值，分析抗APF抗體與病情進展的關系，發(fā)現(xiàn)抗APF在RA診斷有更高的靈敏度，抗APF和抗CCP與關節(jié)外器官受累有關，發(fā)現(xiàn)抗APF與RA病程和晨僵均呈正相關。但本研究為回顧性單中心研究，有可能存在選擇性偏移。