孟偉陽 李永領(lǐng) 聞浩 潘達(dá) 陳健 金燦 葉孫志 陳大慶

動脈粥樣硬化（atherosclerosis,AS）的特征是血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)斑塊堆積[1]。血管內(nèi)皮損傷是AS的始發(fā)事件和致病因素，主要由氧化型低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL）引起[2]。ox-LDL破壞血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化還原平衡，導(dǎo)致內(nèi)皮損傷，從而誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[3]。氧化應(yīng)激通過增加超氧陰離子促進(jìn)血管壁的低密度脂蛋白（low-density lipoprotein,LDL）氧化，而大量的ox-LDL進(jìn)一步損害血管內(nèi)皮細(xì)胞[4]。內(nèi)皮細(xì)胞因損傷發(fā)生凋亡是AS發(fā)展過程中最初但可逆的步驟[5]。因此，預(yù)防內(nèi)皮損傷及細(xì)胞凋亡已成為逆轉(zhuǎn)AS的一種治療策略。研究表明，傳統(tǒng)中藥三七對血液和心血管系統(tǒng)具有良好的調(diào)節(jié)作用[6-7]。三七皂苷 R1（notoginsenoside R1,NGR1）是三七中起主要生物學(xué)作用的成分，具有抗炎、抗氧化、抗凋亡作用[8-9]。然而，目前關(guān)于NGR1是否可以預(yù)防ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡以及增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞的黏附和遷移能力尚未明確。本研究通過ox-LDL建立AS的體外細(xì)胞實驗?zāi)Ｐ?，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，并且探討NGR1對ox-LDL損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用及其機(jī)制，為NGR1防治心血管疾病提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系（human umbilical vein endothelial cells,HUVECs,h055）購于南京 BERKE biology公司。鈣黃綠色（Calcein AM,C2012）購于上海Beyotime公司。NGR1（HY-N0615）購于美國 MedChem-Express公司。結(jié)晶紫（HT90132）、二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide,DMSO,D2650）購于美國Sigma公司。CCK-8（CK04）購于日本DOJINDO公司。Transwell小室（3422）購于美國康寧公司。兔抗人B淋巴細(xì)胞瘤-2蛋白（Bcl-2，#3498）、Bcl-2 相關(guān) X 蛋白（Bax，#14796）多克隆抗體和4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，#4083）購于美國CST公司。兔抗人Cleaved-caspase-3（ab49822）多克隆抗體以及Dylight 594驢抗兔二抗（ab96921）均購于美國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、處理以及分組 HUVECs使用高糖完全培養(yǎng)基（含10%FBS以及100 U/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素）培養(yǎng)，待細(xì)胞密度長至80%～90% 時，用PBS將細(xì)胞培養(yǎng)液清洗干凈后，加入含0.02%EDTA的胰酶消化細(xì)胞。待細(xì)胞全部脫壁漂浮后，加入3倍體積的完全培養(yǎng)基中和胰酶消化，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，用完全培養(yǎng)基重懸HUVECs，將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×104個/ml的細(xì)胞懸液待用。將NGR1粉劑（10 mg）溶于 DMSO（357.2 μl）中，配成 30 mmol/L 的母液保存于-20℃冰箱待用。將體外培養(yǎng)HUVECs分為對照組、損傷組（ox-LDL組）和4種濃度NGR1治療組（ox-LDL+不同濃度NGR1組）。

1.2.2 NGR1藥物毒性及其對HUVECs增殖活性影響檢測 將上述細(xì)胞懸液接種于96孔板中（100 μl/孔）。將培養(yǎng)板放在37℃、5% CO2條件下的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞完全貼壁后，分別將不同濃度的NGR1（7.5、15、30、60 μmol/L）溶液加入對應(yīng)的 96 孔板中，再放入細(xì)胞培養(yǎng)箱預(yù)處理48 h。用于藥物毒性測試的細(xì)胞，將每孔中的藥物洗凈后，加入10 μl CCK-8溶液；用于增殖活性檢測的細(xì)胞將每孔中的藥物洗凈后，加入ox-LDL 50 mg/L刺激24 h，再加入10 μl CCK-8溶液。空白組為 100 μl PBS，再加入 10 μl CCK-8溶液。將加入CCK-8溶液的培養(yǎng)板移入培養(yǎng)箱中避光孵育1 h，隨后取出培養(yǎng)板，用全自動酶標(biāo)儀測定每孔的吸光度，測定波長為 450 nm，并計算細(xì)胞增殖活性，細(xì)胞增殖活性=[（實驗組吸光度-空白組吸光度）/（對照組吸光度-空白組吸光度）]×100%。每個樣品每次含有3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

1.2.3 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白（Bcl-2、Bax、Cleaved-caspase-3）表達(dá)檢測 采用Western blot法。各組HUVECs用RIPA裂解液裂解后，使用BCA試劑盒檢測蛋白濃度并配平每組蛋白的上樣量。配制蛋白樣品時保證20 μl樣品中含30 μg蛋白；12% SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜后，用5%脫脂牛奶常溫封閉2 h。隨后將PVDF膜放入相應(yīng)的抗體孵育盒中（Bcl-2、Bax、Cleaved-caspase-3 抗體按1∶1 000的比例稀釋），在4℃搖床上孵育過夜；一抗孵育結(jié)束之后，將PVDF膜用TBST漂洗3次，5 min/次，再將PVDF膜轉(zhuǎn)入HRP結(jié)合的二抗孵育盒，放于搖床上，室溫孵育2 h后再用TBST漂洗3次，5 min/次；二抗孵育結(jié)束之后，將ECL顯色液均勻敷在膜上，在凝膠成像儀上曝光成像，并用Image J軟件分析計算各組蛋白條帶的灰度值。

1.2.4 細(xì)胞凋亡檢測 采用免疫熒光法。將上述細(xì)胞懸液接種于24孔板中（500 μl/孔）。待細(xì)胞完全貼壁后，向各孔中分別加入15、30 μmol/L NGR1預(yù)處理48 h，然后再用ox-LDL 50mg/L刺激24 h。隨后用4%多聚甲醛固定HUVECs 15 min，0.1% Triton通透15 min，5%山羊血清封閉 2 h，最后將Cleaved-caspase-3一抗（1∶200）稀釋，加入到各個孔中，4℃冰箱孵育過夜。第2天取出24孔板，37℃復(fù)溫1 h后，吸凈一抗，并用PBS清洗3次，5 min/次，隨后加入驢抗兔Dylight 594二抗（1∶300稀釋），37℃孵育 1 h后，吸凈二抗，并用PBS清洗3次，5 min/次，最后加入DAPI染核 5 min，應(yīng)用抗熒光淬滅劑封固。在熒光顯微鏡下觀察染色的細(xì)胞（即凋亡細(xì)胞），通過Image J軟件分析并計算各組不同視野下的Cleaved-caspase-3的平均熒光強(qiáng)度。

1.2.5 細(xì)胞黏附能力檢測 采用鈣黃綠素細(xì)胞膜標(biāo)記染色。將 HUVECs經(jīng) 15、30 μmol/L NGR1預(yù)處理 48 h及ox-LDL 50mg/L刺激24 h后，用胰酶消化并用完培重懸每組細(xì)胞。隨后每組細(xì)胞懸液中加入鈣黃綠素染色工作液，37℃孵育30 min。孵育結(jié)束后，1 000 r/min離心5 min，吸除上清液，緩慢加入37℃預(yù)熱的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。再次以1 000 r/min離心5min，以充分去除殘留的染色液。最后將鈣黃綠素標(biāo)記的HUVECs接種于預(yù)包被人纖維連接蛋白1 μg/ml的培養(yǎng)板中，37℃孵育30 min，然后用PBS清洗3次，5 min/次，將未貼壁的HUVECs洗凈。在倒置熒光顯微鏡下觀察并計數(shù)5個隨機(jī)視野。

1.2.6 細(xì)胞遷移能力檢測 采用Transwell遷移試驗。將HUVECs經(jīng) 15、30 μmol/L NGR1 預(yù)處理 48 h 及 ox-LDL 50mg/L刺激24 h后，用胰酶消化并用無血清的高糖DMEM培養(yǎng)基重懸每組細(xì)胞，將200 μl的細(xì)胞懸液置于孔徑為8 μm的Transwell小室上部。最后將高糖DMEM 培養(yǎng)基（700 μl，含 2% FBS）加入小室的下部。將Transwell板在37℃下培養(yǎng)48 h。棄去培養(yǎng)基，用濕棉簽擦拭每個Transwell小室膜的上層部分以除去未遷移細(xì)胞。遷移細(xì)胞用4%多聚甲醛固定，并用0.2%結(jié)晶紫染色。從6個隨機(jī)選擇的顯微鏡視野計數(shù)平均遷移細(xì)胞數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用Graphpad Prism 5.0統(tǒng)計軟件。計量資料用表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度NGR1作用后HUVECs增殖活性的比較 與對照組相比，NGR1治療組HUVECs的增殖活性逐漸提高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；HUVECs的增殖活性隨著NGR1濃度的增加而增加，在30 μmol/L時達(dá)到高峰，隨后增加NGR1濃度至60 μmol/L時，HUVECs的增殖活性反而出現(xiàn)少許下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表 1。

表1 不同濃度NGR1作用后HUVECs增殖活性的比較

2.2 不同濃度NGR1作用后ox-LDL誘導(dǎo)HUVECs增殖活性的比較 與對照組相比，損傷組的細(xì)胞增殖活性顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與損傷組相比，NGR1治療組細(xì)胞增殖活性顯著增加，在NGR1治療濃度為30 μmol/L時，其抗ox-LDL所誘導(dǎo)的凋亡效果達(dá)到峰值，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；隨后繼續(xù)增加濃度至60 μmol/L時，NGR1治療組HUVECs細(xì)胞的增殖活性反而有所下降，說明高濃度NGR1存在一定的細(xì)胞毒性。NGR1發(fā)揮抗凋亡活性以30 μmol/L為最適宜濃度，所以選取15和30 μmol/L NGR1的治療濃度用于后續(xù)實驗，見表2。

表2 不同濃度NGR1作用后ox-LDL誘導(dǎo)HUVECs增殖活性的比較

2.3 各組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的比較 與對照組比較，損傷組凋亡相關(guān)蛋白Bax、Cleaved-caspase-3的表達(dá)明顯上升（P＜0.05），而Bcl-2蛋白表達(dá)明顯下降（均P＜0.05）；而與損傷組比較，NGR1治療組中 Bax、Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)顯著下降（均P＜0.05），而Bcl-2蛋白表達(dá)明顯上升（P＜0.05），且凋亡相關(guān)蛋白皆呈濃度依賴性，見圖1和表3。

圖1 各組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的電泳圖（NGR1為三七皂苷R1；ox-LDL為氧化型低密度脂蛋白；Bcl-2為兔抗人B淋巴細(xì)胞瘤-2蛋白；Bax為Bcl-2相關(guān)X蛋白）

表3 各組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的比較

2.4 各組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Cleaved-caspase-3表達(dá)的比較 與對照組比較，損傷組HUVECs內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白Cleaved-caspase-3表達(dá)增強(qiáng)，而在NGR1治療組中，這種情況得到明顯改善，凋亡相關(guān)蛋白Cleaved-caspase-3表達(dá)顯著減弱，見圖2（插頁）和表4。

表4 各組細(xì)胞凋亡蛋白Cleaved-caspase-3表達(dá)情況的比較

圖2 各組凋亡相關(guān)蛋白Cleaved-caspase-3染色圖（NGR1為三七皂苷R1；ox-LDL為氧化型低密度脂蛋白；免疫熒光，×40）

2.5 各組細(xì)胞黏附能力的比較 與對照組比較，損傷組HUVECs的細(xì)胞黏附能力顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與損傷組比較，NGR1治療組HUVECs的細(xì)胞黏附能力顯著提高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；黏附細(xì)胞個數(shù)隨著NGR1濃度的增加而增大，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖 3（插頁）和表 5。

圖3 各組細(xì)胞黏附能力檢測結(jié)果（NGR1為三七皂苷R1；ox-LDL為氧化型低密度脂蛋白；鈣黃綠素染色，×10）

表5 各組細(xì)胞黏附細(xì)胞數(shù)的比較

2.6 各組細(xì)胞遷移能力的比較 與對照組比較，損傷組HUVECs的細(xì)胞遷移能力顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與損傷組比較，NGR1治療組HUVECs的細(xì)胞遷移能力顯著提高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；遷移細(xì)胞數(shù)隨著NGR1濃度的增加而增大，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖 4（插頁）和表6。

圖4 各組細(xì)胞遷移能力檢測結(jié)果（NGR1為三七皂苷R1；ox-LDL為氧化型低密度脂蛋白；結(jié)晶紫染色，×20）

表6 各組細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù)的比較

3 討論

AS的發(fā)展是一個相對較復(fù)雜的過程[5]，目前，AS確切的發(fā)病機(jī)制仍不清楚。許多研究表明，ox-LDL通過激活活性氧自由基（ROS）和丙二醛（MDA）誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，通過釋放炎性細(xì)胞因子刺激炎癥，進(jìn)而導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷，最終引起內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡[10-11]。研究顯示，Bcl-2家族和caspase家族在細(xì)胞凋亡轉(zhuǎn)導(dǎo)通路尤其是線粒體途徑中發(fā)揮了極為重要的調(diào)控作用。Bcl-2、Bax蛋白位于線粒體上游，是線粒體膜的通透性改變的重要調(diào)控因素，其過度表達(dá)能控制其下游caspase-3蛋白酶的活化，介導(dǎo)細(xì)胞的存活或死亡[12]。因此caspase-3被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵酶。當(dāng)全長caspase-3（32kD）被激活時，它被切割形成兩個成熟亞基：p17（17kD）和 p12（12kD）；進(jìn)而 Cleaved-caspase-3水平代表活化的caspase-3水平[13-14]。所以，檢測內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡水平是衡量ox-LDL對細(xì)胞影響的有效方法。本研究發(fā)現(xiàn)ox-LDL可以顯著誘導(dǎo)HUVECs凋亡，而NGR1的干預(yù)可以明顯緩解其凋亡的發(fā)生，并且可以改善內(nèi)皮細(xì)胞的黏附和遷移能力。

三七是五加科植物的一員，作為傳統(tǒng)中藥已有數(shù)千年的歷史，特別是根莖常被臨床用來維持人體微環(huán)境穩(wěn)態(tài)，并用于治療心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)以及代謝相關(guān)疾病[15-17]。其中NGR1是三七中發(fā)揮最主要藥理學(xué)效益的生物活性物質(zhì)[16]。近年來，越來越多的證據(jù)表明，NGR1具有多種生物活性，包括心血管保護(hù)[8]、神經(jīng)保護(hù)[18]和抗腫瘤[19]。本研究選取人正常內(nèi)皮細(xì)胞HUVECs為實驗材料，通過ox-LDL誘導(dǎo)建立內(nèi)皮細(xì)胞凋亡模型，通過CCK-8檢測初步探討NGR1是否具有拮抗由ox-LDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的功能。本研究結(jié)果表明，NGR1可以發(fā)揮抗凋亡的作用，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞，增加其細(xì)胞增殖活性，減少caspase-3的激活。為了探索存活下的內(nèi)皮細(xì)胞功能是否完整，本研究進(jìn)行了細(xì)胞遷移和細(xì)胞黏附實驗，結(jié)果顯示HUVECs用NGR1治療后，顯著改善了由ox-LDL造成的內(nèi)皮細(xì)胞功能的減退，提高了HUVECs的黏附和遷移能力。

本研究采用ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs內(nèi)皮細(xì)胞凋亡模型來觀察NGR1的抗凋亡作用。結(jié)果表明，NGR1通過抑制ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs增殖活性降低、細(xì)胞凋亡增多、caspase-3蛋白的表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞遷移和黏附減少，從而發(fā)揮其對ox-LDL損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用。因缺乏體內(nèi)實驗的驗證，本研究的結(jié)果具有一定的局限性，但為NGR1的進(jìn)一步開發(fā)提供了一定的理論基礎(chǔ)。