石瑩 王靈聰 周霞慶 蔣慧芳

創(chuàng)傷性腦損傷（traumatic brain injury,TBI）因其高發(fā)病率、高致殘率和高病死率，以及造成的社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，目前仍然是全球醫(yī)療界關(guān)注的熱點(diǎn)問題之一[1-3]。近年來研究發(fā)現(xiàn)自噬在TBI中發(fā)揮了重要作用[4]，而NF-κB特異性抑制劑吡咯醛二硫氨基甲酸酯（pyrrolidinedithiocarbamate,PDTC）對TBI后繼發(fā)性腦損傷具有保護(hù)作用[5]，既往研究發(fā)現(xiàn)腦缺血大鼠存在自噬，處理腦缺血能促進(jìn)腦組織微管相關(guān)蛋白輕鏈3-Ⅱ（LC3-Ⅱ）和自噬相關(guān)蛋白Beclin1表達(dá)上升，減輕腦缺血再灌注損傷[6]；傳統(tǒng)中藥三七能減輕TBI大鼠腦出血，明顯改善神經(jīng)功能缺陷評分[7]。筆者在上述研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討三七、PDTC對TBI大鼠腦組織自噬、神經(jīng)功能恢復(fù)的作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 SD雄性大鼠36只，SPF級，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司 [生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2017-0005]，體重（250±20）g；三七粉購自杭州華東中藥飲片有限公司；PDTC（vn27735X）以及自噬抑制劑氯喹（50-63-5）購自美國Sigma公司。p62一抗（ab56416）、Beclin1一抗（ab207612）、LC3一抗（ab128025）購自英國Abcam公司。

1.2 儀器和設(shè)備 SpectraMax Plus 384型全波長酶標(biāo)儀購自美國MD公司，電泳系統(tǒng)、凝膠成像儀購自美國Bio-RAD公司，H1650R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)購自湖南湘儀公司，TD5A型臺(tái)式低速離心機(jī)購自湖南凱達(dá)公司，ZH-RXZ柔性顱骨轉(zhuǎn)購自淮北正華公司，顯微鏡購自日本OLYMPUS公司（BX43），TECNAI10型透射電鏡購自荷蘭飛利浦公司。實(shí)驗(yàn)前所有儀器設(shè)備均校準(zhǔn)。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物分組、模型制備及處理 按隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為假手術(shù)組（SHAM組）、模型組（M組）、三七組（PN組）、PDTC組（PDTC組）、三七聯(lián)合 PDTC組（PN+PDTC組）、三七聯(lián)合氯喹組（PN+CHQ組），每組6只。除SHAM組外，其余各組大鼠均行TBI模型制備：戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉，采用改良的Feeney自由落體模型制備法，具體詳見文獻(xiàn)[7]。SHAM組大鼠進(jìn)行上述手術(shù)及麻醉程序，但無腦組織沖擊損傷過程。6組大鼠術(shù)前3 d、術(shù)后3 d予0.9%氯化鈉注射液1 ml每天分2次灌胃（每次0.5 ml），術(shù)前 1 d、術(shù)后3 d予0.9%氯化鈉注射液1 ml腹腔注射，1次/d。PN組灌胃時(shí)加入三七粉2.5 g/kg（既往實(shí)驗(yàn)篩選出最佳劑量[7]）。PDTC組腹腔注射時(shí)加入PDTC 120 mg/kg。PN+PDTC組灌胃時(shí)加入三七粉2.5 g/kg，腹腔注射時(shí)加入PDTC 120 mg/kg。PN+CHQ組灌胃時(shí)加入三七粉2.5 g/kg，腹腔注射時(shí)加入氯喹60 mg/kg。各組大鼠手術(shù)后第4天用戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉處死，取大鼠大腦組織進(jìn)行檢測。為避免人為誤差，麻醉、手術(shù)、取材步驟分別由專人進(jìn)行操作。

1.3.2 神經(jīng)功能缺陷評分 造模后12、24、72 h由不清楚分組情況的3位觀察者根據(jù)改良的7分法[8-9]獨(dú)立進(jìn)行神經(jīng)功能缺陷評分，6分：提起鼠尾時(shí)雙前肢能正常伸展；5分：提起鼠尾時(shí)雙前肢能協(xié)調(diào)地偏向傷側(cè)；4分：對于來自傷側(cè)橫向推動(dòng)力的抵抗減弱；3分：提起及拉住鼠尾時(shí)能向癱瘓側(cè)打圈；2分：拉住鼠尾時(shí)主動(dòng)向癱瘓側(cè)打圈；1分：主動(dòng)向癱瘓側(cè)打圈；0分：無自主活動(dòng)。各組取平均分進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.3.3 腦組織制作切片 各組大鼠腦組織在4%甲醛溶液中固定3～5 d；再經(jīng)過不同濃度乙醇進(jìn)行脫水處理；二甲苯透明處理；浸蠟包埋后切片，厚度4 μm；最后放入65℃恒溫箱中烤片6～12 h。

1.3.4 HE染色以及Nissl染色 HE染色：腦組織染色后鏡下觀察，對各個(gè)樣本做綜合性病理描述。Nissl染色：脫蠟復(fù)水后切片浸入甲苯胺藍(lán)溶液染色后水洗，冰醋酸分化后水洗，風(fēng)干后二甲苯透明并封片，鏡下選擇損傷區(qū)或損傷區(qū)附近的神經(jīng)元觀察，對比各組神經(jīng)元尼氏體變化。

1.3.5 腦組織透射電鏡檢查 取腦組織塊，2.5%戊二醛（含1%鋨酸）固定1 h；0.1 M PBS沖洗15 min×2次；2%醋酸鈾水溶液染色30 min；50%、70%、90%乙醇依次脫水，各15 min×1次；100%乙醇脫水20 min×1次；100%丙酮脫水20 min×2次；無水丙酮與包埋劑按1∶1體積混合滲透組織，并震蕩2 h；純包埋劑滲透組織，并震蕩2 h，并置于烘箱內(nèi)聚合：37℃聚合24 h，45℃聚合24 h，60℃聚合48 h；修塊后并超薄切片（約120 nm）；4%醋酸鈾染色20 min，枸櫞酸鉛染色5 min；將染色后的超薄切片放到單孔銅網(wǎng)上，TECNAI 10透射電鏡下觀察并拍照。

1.3.6 Western blot檢測腦組織p62、Beclin1和LC3水平 取組織蛋白樣品，根據(jù)BCA法測定的蛋白濃度，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳：上樣量為每泳道30 μg，電泳后的凝膠轉(zhuǎn)PVDF膜，將PVDF膜浸入含5% BSA的封閉液中，室溫封閉1 h。取出已封閉的PVDF膜，浸于1×TBST緩沖液中洗滌5 min。然后移入含有p62、Beclin1或LC3的一抗的孵育盒中，4℃孵育過夜。1×TBST緩沖液洗滌后。將PVDF膜轉(zhuǎn)移到含二抗（Goat anti-Mouse IgG）的抗體孵育盒中，室溫孵育2 h。TBST緩沖液洗滌后，把ECL試劑盒中等體積的A液和B液混合，混勻后加在膜的表面，移入凝膠成像分析儀中，化學(xué)光敏模式曝光顯影。ChemiDoc系統(tǒng)采集發(fā)光圖像，使用Image J軟件計(jì)算鑒定條帶的綜合吸光度（IA），按下式計(jì)算各蛋白的表達(dá)情況：相對蛋白表達(dá)=IA（目的蛋白）/IA（內(nèi)參蛋白）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 6組大鼠造模前及造模后12、24、72 h神經(jīng)功能缺陷評分的比較 6組大鼠造模前進(jìn)行神經(jīng)功能缺陷評分均為6分。造模后，SHAM組大鼠神經(jīng)功能缺陷評分正常，其余各組大鼠造模后均出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能缺陷，表現(xiàn)為拉住鼠尾向?qū)?cè)打圈，來自傷側(cè)橫向推動(dòng)力的抵抗減弱等。與SHAM組比較，各組12、24、72 h神經(jīng)功能缺陷評分均明顯降低（均P＜0.01）。PN組、PDCT組、PN+PDCT組、PN+CHQ 組 12、24 h評分與M組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，72 h神經(jīng)功能缺陷評分明顯改善（P＜0.05或0.01）。PN組、PDCT組、PN+PDCT組、PN+CHQ組 12、24、72 h神經(jīng)功能缺陷評分比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見表1。

表1 6組大鼠造模前及造模后12、24、72h神經(jīng)功能缺陷評分的比較（分）

2.2 6組大鼠大腦組織HE染色情況比較 SHAM組結(jié)構(gòu)正常，未見病變。M組腦損傷一側(cè)可見超過50%腦組織溶解缺損，殘存組織可見出血、大量血管、纖維增生和大量炎細(xì)胞浸潤，損傷區(qū)周圍可見神經(jīng)元固縮。PN組HE染色下可見病變同M組，損傷明顯較M組小，約為30%。PDTC組，損傷范圍約為20%，其余病變同M組。PN+PDTC組、PN+CHQ損傷范圍均約為25%，其余病變同M組。見圖1（插頁）。

圖1 6組大鼠大腦組織HE染色情況（SHAM組為假手術(shù)組；M組為模型組；PN組為三七組；PDTC組為NF-κB抑制劑吡咯醛二硫氨基甲酸酯組；PN+PDTC組為三七聯(lián)合PDTC組；PN+CHQ組三七聯(lián)合氯喹組；×200）

2.3 6組大鼠大腦組織Nissl染色情況比較 SHAM組尼氏體位于細(xì)胞核周圍，清晰可見。M組樣本損傷區(qū)附近大量神經(jīng)元尼氏體明顯減少，部分神經(jīng)元僅可見裸露的細(xì)胞核，未見尼氏體。PN組、PDCT組、PN+PDCT組、PN+CHQ組損傷區(qū)或損傷區(qū)附近，少數(shù)神經(jīng)元內(nèi)可見尼氏體，相較M組，病變有所減輕。見圖2（插頁）。

圖2 6組大鼠大腦組織Nissl染色情況（SHAM組為假手術(shù)組；M組為模型組；PN組為三七組；PDTC組為NF-κB抑制劑吡咯醛二硫氨基甲酸酯組；PN+PDTC組為三七聯(lián)合PDTC組；PN+CHQ組三七聯(lián)合氯喹組；×200）

2.4 6組大鼠大腦組織透射電鏡情況比較 SHAM組可見神經(jīng)元形態(tài)正常，細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)和細(xì)胞器分布均勻，未見病變。M組可見細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)固縮，細(xì)胞質(zhì)分布不均勻或空泡化，多數(shù)細(xì)胞器空泡、基質(zhì)溶解消失，細(xì)胞質(zhì)中可見大量自噬體，是所有樣本中自噬最多的組別。PN組、PDCT組、PN+PDCT組、PN+CHQ組細(xì)胞質(zhì)內(nèi)均可見大量自噬體，但較M組少；局部細(xì)胞質(zhì)空泡化，但仍可見正常的細(xì)胞器，相對M組有所減輕。見圖3。

圖3 6組大鼠大腦組織透射電鏡情況（SHAM組為假手術(shù)組；M組為模型組；PN組為三七組；PDTC組為NF-κB抑制劑吡咯醛二硫氨基甲酸酯組；PN+PDTC組為三七聯(lián)合PDTC組；PN+CHQ組為三七聯(lián)合氯喹組；×10 000）

2.5 6組大鼠大腦組織中p62、Beclin1和LC3表達(dá)的比較 各組大鼠造模3 d后取大腦組織測定p62、Beclin1和LC3表達(dá)，M組比SHAM組明顯增加（P＜0.05或0.01）。PN組、PDCT組、PN+PDCT組、PN+CHQ 組p62、Beclin1和LC3表達(dá)較M組明顯下降（P＜0.05或0.01）。PN組、PDCT組、PN+PDCT組、PN+CHQ組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見表2和圖4。

圖4 6組大鼠腦組織p62、Beclin1和LC3表達(dá)（SHAM組為假手術(shù)組；M組為模型組；PN組為三七組；PDTC組為NF-κB抑制劑吡咯醛二硫氨基甲酸酯組；PN+PDTC組為三七聯(lián)合PDTC組；PN+CHQ組三七聯(lián)合氯喹組）

表2 6組大鼠大腦組織中p62、Beclin1和LC3表達(dá)的比較

3 討論

本實(shí)驗(yàn)研究了TBI大鼠自噬發(fā)生情況以及三七、PDTC藥物干預(yù)后的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大鼠腦部創(chuàng)傷發(fā)生后存在自噬并伴有腦功能損傷，表現(xiàn)為神經(jīng)功能缺陷評分明顯下降，HE染色和Nissl染色腦組織損傷明顯，透射電鏡下腦細(xì)胞中可見大量自噬體，自噬蛋白明顯升高。既往研究中發(fā)現(xiàn)三七以及PDTC對TBI大鼠腦組織有保護(hù)作用[5，7]，在本研究中，三七以及PDTC均能改善TBI大鼠神經(jīng)功能缺陷評分，同時(shí)HE染色和Nissl染色腦組織損傷較M組改善，透射電鏡下腦細(xì)胞中可見自噬體較M組減少，自噬蛋白下降，說明三七以及PDTC均能干預(yù)TBI大鼠自噬過程，促進(jìn)腦功能恢復(fù)。對比三七以及PDTC兩組，PDTC在HE染色中，腦組織損傷范圍較PN組略有優(yōu)勢，其余差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。三七聯(lián)合PDTC以及三七聯(lián)合氯喹在上述各觀測指標(biāo)上與PN組和PDTC組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明三七與PDTC以及三七與氯喹并無明顯協(xié)同作用。

三七為五加科植物三七的干燥根，傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為三七不僅能止血，又能活血散瘀，有“止血而不留瘀，化瘀而不傷正”的特點(diǎn)，被譽(yù)為“血證良藥”。筆者團(tuán)隊(duì)臨床觀察中發(fā)現(xiàn)三七粉對顱腦損傷患者深靜脈血栓形成（deep venous thrombosis,DVT）的防治有一定效果，14 d后D二聚體水平以及靜脈栓塞發(fā)生率三七組明顯低于對照組，PT、APTT、PLT改變不明顯[10]。既往研究也發(fā)現(xiàn)三七治療腦出血合并DVT大鼠，出血量、血腫程度和梗死面積明顯少或減輕，結(jié)扎血管栓塞明顯好轉(zhuǎn)，而且能一定程度上雙向調(diào)節(jié)血小板活化因子CD62P的表達(dá)[11]，且高濃度三七對預(yù)防和治療大鼠靜脈血栓栓塞均有效[12]。因此三七或許是高危靜脈栓塞合并出血風(fēng)險(xiǎn)最有潛力的防治藥物。本研究在前期基礎(chǔ)上對三七干預(yù)TBI大鼠自噬進(jìn)行了進(jìn)一步探討，對于完善三七作用機(jī)制研究具有十分重要的意義。NF-κB是細(xì)胞內(nèi)重要的核轉(zhuǎn)錄因子，它參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答，能調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、應(yīng)激反應(yīng)，與自噬相互調(diào)節(jié)[13]。本研究中PDTC作為NF-κB的特異性抑制劑，能干預(yù)TBI大鼠自噬過程，促進(jìn)腦功能恢復(fù)，但三七與PDTC無明顯協(xié)同作用。同樣，三七與氯喹亦未見明顯協(xié)同作用，這對今后臨床用藥選擇提供有效的借鑒。

近年來越來越多的研究發(fā)現(xiàn)TBI自噬是十分復(fù)雜的過程，它對于TBI起保護(hù)性作用還是損害性作用，TBI后自噬是增強(qiáng)還是減弱，沒有定論，仍需深入研究[14]。本研究發(fā)現(xiàn)造模3d大鼠腦細(xì)胞中可見大量自噬體，自噬蛋白明顯升高，但對TBI后自噬情況亦無法定論，這也是本研究的不足之處。今后研究中將進(jìn)一步細(xì)化，定量自噬流變化，同時(shí)增加觀測時(shí)間點(diǎn)，以期更明確相關(guān)機(jī)制，從而更有效地服務(wù)臨床。