朱燁靜 周惠丹 崔小英 錢琳艷 方軍 姜慧芳 許宏亮

作為婦科惡性腫瘤中惡性程度最高的卵巢癌，約70%發(fā)現(xiàn)時已是晚期[1]。而卵巢癌根治術(shù)創(chuàng)傷大、時間長，使患者在手術(shù)及術(shù)后發(fā)生心血管不良事件的風險大大增加。瑞芬太尼作為起效迅速、鎮(zhèn)痛效果確切的一種阿片類藥物，既能確保手術(shù)過程中鎮(zhèn)痛效果良好，又能在手術(shù)結(jié)束后迅速消散，但手術(shù)中大劑量長時間輸注會出現(xiàn)心肌抑制的不良反應(yīng)。有研究發(fā)現(xiàn)，大劑量瑞芬太尼能增加大鼠心肌氧化應(yīng)激，且隨著劑量的增加和輸注時間的延長，心肌損傷程度也不斷加重[2]。但目前對大劑量瑞芬太尼抑制心肌機制的研究甚少。因此，本研究旨在探討鈣敏感受體（calciumsensing recetor,CaSR）在持續(xù)大劑量輸注瑞芬太尼誘導卵巢癌裸鼠心肌損傷中的作用機制及信號通路，以期為防治大劑量阿片類藥物的心肌抑制作用提供有效的靶點。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和材料 Nc-nu裸鼠40只（6～8周，20～25 g）[中國科學院上海實驗動物中心，許可證號：SCXK（滬）2016-2017]；瑞芬太尼（1 mg/支，國藥準字：90A08061，湖北宜昌人福藥業(yè)公司）；人卵巢癌細胞株SKOV3（廣州富恒生物），CaSR 抗體（200 μg/支，美國 Cell Signaling公司）；蓬亂蛋白同源物（Dvl-1）抗體和βactin（1 mg/支，美國 Santa Cruz公司），β 連環(huán)蛋白（βcatenin）抗體（1 mg/支，美國 Santa Cruz公司）；CaSR 抑制劑 Calhex231（1 mg/瓶，美國 Santa Cruz公司）；蛋白裂解緩沖液（北京索萊寶公司）；蛋白酶抑制劑（PMSF）和辣根過氧化物酶（HRP）（上海碧云天公司）；肌酸激酶（CK）和乳酸脫氫酶（LDH）測定試劑盒（南京建成生物醫(yī)學工程研究所）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組和模型制備 將40只裸鼠按隨機數(shù)字表法分為空白對照組（C組）、模型對照組（O組）、瑞芬太尼輸注組（R組）和瑞芬太尼+CaSR拮抗劑Calhex231組（R+C組），每組10只。除C組外，O組、R組、R+C組均進行卵巢癌模型構(gòu)建：將人卵巢癌細胞株SKOV3（卵巢漿液性乳頭狀腺癌）培養(yǎng)于含10% FBS、100 U/ml青霉素和 100 U/ml鏈霉素的 RPMI-1640培養(yǎng)液中，37℃、5% CO2孵箱中孵育，選用對數(shù)生長期細胞，經(jīng)胰酶消化，制備成107個/ml的懸浮液，在每只裸鼠腋部皮下進行注射，皮下移植瘤呈囊形，15 d后基本成瘤，表示建模成功。模型建立后，R組泵注瑞芬太尼20 μg（/kg·min）持續(xù)1 h，R+C組尾靜脈注射濃度為10-3mol/L的 Calhex231（每100 mg給予0.1 μl），48 h后泵注瑞芬太尼20 μg（/kg·min）持續(xù)1 h；C組、O組均輸注等量0.9%氯化鈉注射液。

1.2.2 標本采集 注射上述藥物后，即刻于裸鼠內(nèi)眥靜脈內(nèi)取盡血，2 500～3 000 r/min離心5 min，取上層血清備用。斷頸處死裸鼠，取部分心肌組織，4%多聚甲醛中室溫固定18～24 h。

1.3 觀察指標

1.3.1 血清 CK、LDH水平測定 采用酶聯(lián)免疫法檢測血清中CK和LDH水平。操作按試劑盒說明書進行。

1.3.2 心肌組織常規(guī)病理檢查 心肌組織常規(guī)石蠟包埋，3～5 μm切片，以備HE染色使用。將石蠟切片從4℃冰箱中取出后涼干，60℃烤箱中加熱，二甲苯中脫蠟3次，依次梯度乙醇逐級浸泡，自來水洗，浸入蘇木精染液3～5 min染核，弱堿性水溶液顯藍30～60 s；0.5%伊紅染色 2～3 min，蒸餾水洗 1～2 s，梯度乙醇逐級脫水，二甲苯透明，并用中性樹膠封片，光鏡下觀察各組裸鼠心肌細胞損傷情況。

1.3.3 CaSR及Dvl-1、β-catenin蛋白表達檢測 剩余心肌組織，存儲-80℃冰箱以備提取蛋白使用。采用免疫組化法檢測CaSR表達及分布情況，藍染為細胞核，細胞質(zhì)及膜呈棕色為CaSR表達。采用Western blot檢測CaSR、Dvl-1、β-catenin蛋白表達：按每100 mg組織加入150～200 ml蛋白裂解緩沖液及PMSF，充分混勻，4℃下放置40 min，12 000 r/min 4℃離心20 min，取上清液進行蛋白定量。按步驟配膠、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜等，一抗 CaSR（1∶500）、Dvl-1（1∶200）、β-catenin（1∶1 000）和 β-actin（1∶500）4 ℃冰箱孵育過夜，洗膜，將膜放入HRP標記的二抗（1∶5 000）中室溫孵育30 min，ECL顯色。應(yīng)用Image J軟件對圖片中條帶進行灰度測量，目的蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參灰度值。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用方差分析，方差齊性兩兩比較采用LSD-t檢驗，方差不齊采用 Dunnett's T3檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 4組裸鼠血清CK和LDH水平的比較 與C組及O組相比，R組裸鼠血清CK和LDH水平升高（均P＜0.05），而R+C組無明顯變化（P＞0.05）。與R組相比，R+C組血清CK和LDH水平均明顯降低（均P＜0.05）。見表1。

表1 4組裸鼠血清CK和LDH水平的比較（U/L）

2.2 4組裸鼠心肌細胞形態(tài)學的變化 光鏡下可見C組心肌細胞形態(tài)排列正常，條紋清晰，肌纖維粗而長，細胞核中染色質(zhì)疏松，密度均勻；O組心肌細胞形態(tài)排列尚可，少量炎細胞浸潤；R組心肌組織進行性纖維化為特征，表現(xiàn)為心肌細胞腫脹，心肌間隙增寬，肌纖維排列紊亂，橫紋不清晰；R+C組心肌細胞排列略紊亂，少量炎細胞浸潤，散在的單個心肌細胞表現(xiàn)為局部肌漿溶解和空泡，而鄰近的心肌細胞仍正常，無明顯纖維化表現(xiàn)，見圖1（插頁）。

圖1 4組裸鼠光鏡下心肌細胞形態(tài)學的變化（HE染色，×200）

2.3 4組裸鼠心肌細胞CaSR表達及分布情況 光鏡下可見C組及O組細胞核藍染，形態(tài)排列尚可，少量細胞顯示棕色；R組炎細胞浸潤和肌纖維排列紊亂同時，CaSR大量分布細胞質(zhì)及細胞膜；而R+C組心肌細胞質(zhì)少量棕色，形態(tài)排列略紊亂，但無明顯纖維化改變，見圖 2（插頁）。

圖2 4組裸鼠心肌細胞鈣敏感受體（CaSR）表達及分布情況（免疫組化，×200）

2.4 4組裸鼠心肌細胞CaSR、Dvl-1、β-catenin表達的比較 與 C組及 O組比較，R組中 CaSR、Dvl-1和β-catenin表達明顯增加，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；而R+C組心肌組織CaSR、Dvl-1和β-catenin表達無明顯增加，但與R組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖 3。

圖3 4組裸鼠心肌細胞上鈣敏感受體（CaSR）、蓬亂蛋白同源物（Dvl-1）、β連環(huán)蛋白（β-catenin）表達情況（a：各組心肌組織中CaSR、Dvl-1、β-catenin 蛋白電泳圖；b、c、d：各組心肌組織中 CaSR、Dvl-1、β-catenin 蛋白相對表達量；與 C 組比較，*P＜0.05；與 O組比較，▲P＜0.05；與 R 組比較，△P＜0.05）

3 討論

卵巢癌在我國年發(fā)病率居女性生殖系統(tǒng)腫瘤第3位，且呈逐年上升的趨勢，目前手術(shù)及化療是卵巢癌治療的主要手段。而對于此類手術(shù)，創(chuàng)傷大，時間長，術(shù)中長時間輸注阿片類藥物，使患者容易在圍術(shù)期發(fā)生心血管不良事件。有研究發(fā)現(xiàn)，術(shù)中短時間平均動脈壓低于55 mmHg，可能發(fā)生心肌損傷及急性腎損傷[3]。因此，對于需要進行手術(shù)的卵巢癌患者來說，無疑增加了其心肌損傷的程度和猝死的風險。

瑞芬太尼是一種人工合成的新型高選擇性μ受體激動劑，能迅速被血漿非特異性酯酶水解，具有起效快、鎮(zhèn)痛作用強、清除半衰期短、無蓄積、代謝不受肝腎功能的影響等優(yōu)點，目前廣泛應(yīng)用于臨床麻醉。有關(guān)瑞芬太尼對心肌的影響目前存在“保護”、“損傷”雙向性爭議：有研究認為瑞芬太尼對缺血再灌注的心肌具有保護作用[4-5]；也有學者發(fā)現(xiàn)大劑量瑞芬太尼則能增加大鼠心肌氧化應(yīng)激，隨著給藥時間的延長，心肌損傷程度不斷加重[2]。盡管不同研究顯示瑞芬太尼對心臟的影響具有兩面性，但大劑量長時間使用時對心肌損傷的不良反應(yīng)不容小覷。本研究卵巢癌裸鼠進行大劑量瑞芬太尼輸注，發(fā)現(xiàn)血清CK及LDH水平增加，與C組及O組比較差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），提示給予一定大劑量的瑞芬太尼，可引起心肌細胞不同程度的損傷，同時HE染色提示，瑞芬太尼組炎細胞浸潤明顯，心肌細胞腫脹，形態(tài)排列紊亂，這些結(jié)果都提示大劑量瑞芬太尼可以導致一定的心肌損傷。而給予CaSR抑制劑后，再輸注同樣劑量瑞芬太尼后，CK和LDH水平并沒有明顯增加，少量心肌炎細胞浸潤，形態(tài)排列尚可，說明CaSR可能參與了大劑量瑞芬太尼誘導心肌損傷的病理過程。

CaSR是G蛋白耦聯(lián)受體的C家族成員之一，在多種細胞內(nèi)均有廣泛分布。近年來發(fā)現(xiàn) CaSR涉及了多種分子信號通路，在不同器官和組織中發(fā)揮生理病理作用。有研究報道，CaSR激活后，能介導線粒體通路、Fas死亡受體通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路，誘導心肌細胞凋亡[6-8]。同時也有研究發(fā)現(xiàn)，CaSR能使NLPR-3炎癥小體活化，繼而介導了Caspase-1依賴的心肌細胞焦亡分子通路的激活[9-10]。本課題組之前研究發(fā)現(xiàn)CaSR上調(diào)可以介導MAPK途徑的激活引起心肌細胞凋亡[11]。因此可以肯定，CaSR作為心肌細胞內(nèi)信號激活，通過細胞間信號通路匯集、呈遞、交互對話的調(diào)節(jié)，參與了心肌細胞損傷的過程。本研究結(jié)果也顯示，CaSR在瑞芬太尼誘導卵巢癌裸鼠心肌損傷過程中，起到了一定作用。因此，筆者將繼續(xù)探尋其相關(guān)的分子機制。

Wnt信號通路作為一條潛在、重要的信號轉(zhuǎn)導通路，在心肌肥厚、動脈粥樣硬化等心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的作用[12-13]。Wnt/β-catenin信號途徑被譽為“經(jīng)典Wnt信號途徑”：當Wnt信號出現(xiàn)后，被激活的Dvl和Fz受體相結(jié)合，啟動了下游相應(yīng)的通路。LRP-5/6與支架蛋白Axin結(jié)合，解離了GSK-3β復合物，使β-catenin無法降解而在細胞胞內(nèi)大量聚集，并轉(zhuǎn)位入核，激活了轉(zhuǎn)錄因子如TCF/LEF，從而引起下游靶基因如c-Myc、cyclin等轉(zhuǎn)錄表達，產(chǎn)生相應(yīng)的功能效應(yīng)[14]。Martin等[15]研究發(fā)現(xiàn)激活Wnt通路后可引起心肌細胞的肥大。Zhang等[16]研究發(fā)現(xiàn)調(diào)控Wnt通路和心肌病的發(fā)生有關(guān)。Malekar等[17]研究發(fā)現(xiàn)在Dvl-1過表達的轉(zhuǎn)基因小鼠模型中，Dvl-1過表達可導致嚴重的心肌肥厚，射血分數(shù)降低，心臟重量增加，同時在主動脈結(jié)扎和心力衰竭誘導的心肌肥厚模型中Dvl-1的表達也增加，而Dvl-1敲除的小鼠心肌細胞β-腎上腺素誘導的心肌肥厚效應(yīng)消失，證實Dvl-1作為交互對話的重要分子，起著承接Wnt信號通路的關(guān)鍵樞紐作用。本課題組前期也證實，敲除Dvl-1基因后，能抑制心肌凋亡，減輕心肌損傷[18]。本研究中，大劑量使用瑞芬太尼后，裸鼠心肌細胞中CaSR表達上調(diào)，同時Dvl-1和β-catenin表達增加，而CaSR拮抗劑預處理后，CaSR被抑制，Dvl-1和β-catenin表達也明顯下降，與R組比較差異有統(tǒng)計學意義。這些結(jié)果可以初步說明，在大劑量瑞芬太尼致卵巢癌裸鼠心肌損傷過程中CaSR介導Dvl-1的激活，作為關(guān)鍵樞紐Dvl-1又激活了Wnt/βcatenin通路，從而啟動了心肌損傷的發(fā)生過程。

綜上所述，本研究結(jié)果表明持續(xù)大劑量輸注瑞芬太尼通過激活CaSR介導Dvl-1表達激活Wnt/βcatenin信號途徑誘導卵巢癌裸鼠心肌細胞損傷。