周鐵麗 徐雯雅

近年來(lái)，隨著抗菌藥物的廣泛使用甚至濫用，細(xì)菌的耐藥性不斷增強(qiáng)，呈現(xiàn)出高度耐藥、多重耐藥的趨勢(shì)[1-3]。隨著多重耐藥菌的不斷出現(xiàn)及流行播散，嚴(yán)重細(xì)菌感染性疾病的防控變得愈加困難。噬菌體具有特異性強(qiáng)、不良反應(yīng)小、增殖快且種類豐富等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)作為天然抗菌劑受到人們廣泛關(guān)注。盡管噬菌體具有治療多重耐藥菌感染的潛力，但治療仍存在一些“障礙”。例如，噬菌體的高特異性導(dǎo)致其裂解譜窄；噬菌體與細(xì)菌相互作用時(shí)，細(xì)菌可通過(guò)改變受體、超感染免疫、R-M限制修飾系統(tǒng)、CRISPR系統(tǒng)以及流產(chǎn)感染系統(tǒng)（Abi）對(duì)抗噬菌體的侵襲[4-6]；某些噬菌體可能攜帶毒力基因或耐藥基因，使得細(xì)菌從無(wú)毒性變?yōu)橛卸拘曰驘o(wú)抗性變?yōu)橛锌剐缘?。目前研究表明，無(wú)論在治療成果方面還是在遏制細(xì)菌耐受性演變方面，噬菌體與抗菌藥物聯(lián)合使用的效果均優(yōu)于兩者單獨(dú)使用的效果。這種聯(lián)合治療策略可能是對(duì)抗現(xiàn)在細(xì)菌耐藥時(shí)代的一種合乎邏輯的方法[4]。本文對(duì)噬菌體-抗菌藥物協(xié)同作用的機(jī)制、臨床應(yīng)用現(xiàn)狀及展望作一述評(píng)，為噬菌體-抗菌藥物的進(jìn)一步研發(fā)和應(yīng)用提供參考。

1 噬菌體的生物學(xué)特性及殺菌機(jī)制

1.1 噬菌體的生物學(xué)特性 噬菌體是一種能特異性侵襲細(xì)菌、真菌、螺旋體和支原體等的病毒，只含有一種核酸，DNA或RNA，廣泛存在于水源、土壤等各種環(huán)境甚至人和動(dòng)物體內(nèi)，與人類健康息息相關(guān)[5]。其種類繁多，在自然界中的數(shù)量可以達(dá)到1031，為細(xì)菌數(shù)量的10倍[6]。作為病毒的一種，噬菌體具有病毒的一些特性：個(gè)體微小，不具有完整細(xì)胞結(jié)構(gòu)，只含有單一核酸，可視為一種“捕食”細(xì)菌的生物。噬菌體對(duì)理化因素的抵抗力比一般細(xì)菌的繁殖體強(qiáng)，一般經(jīng)75℃30 min以上才失去活性，對(duì)紫外線敏感[7]。

1.2 噬菌體的殺菌機(jī)制 大多數(shù)用于治療的噬菌體其DNA位于棱柱狀頭部，由蛋白質(zhì)衣殼、刺和附著在細(xì)菌上的尾纖維包裹組成，還有一個(gè)中空管（尾鞘），DNA通過(guò)這個(gè)中空管流入宿主體內(nèi)（圖1）。不同噬菌體的結(jié)構(gòu)可能有所不同。這些無(wú)生命的有機(jī)體依靠它們的細(xì)菌宿主生存，病毒復(fù)制的兩個(gè)主要生命周期包括裂解（或毒性）和溶源（或溫和）周期。毒性噬菌體的工作原理是裂解細(xì)菌細(xì)胞，而溫和噬菌體則在細(xì)胞內(nèi)休眠，不會(huì)立即殺死細(xì)胞[8]。毒性噬菌體的感染是通過(guò)將噬菌體的尾部纖維吸附到細(xì)菌細(xì)胞表面的特定受體上，開始感染毒力強(qiáng)的噬菌體。研究表明細(xì)菌表面存在許多受體，臨床相關(guān)噬菌體針對(duì)的常見受體包括蛋白質(zhì)、碳水化合物和其他主要位于細(xì)菌細(xì)胞壁組件上的細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)（如孔蛋白、外排泵、脂多糖和肽聚糖）[9]。噬菌體通過(guò)酶促過(guò)程推動(dòng)一條管從其鞘中出來(lái)，在細(xì)菌表面形成一個(gè)洞，從而將遺傳物質(zhì)從其衣殼頭部、鞘注入細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)。在理想的條件下，遺傳物質(zhì)能夠接管宿主細(xì)菌的運(yùn)作，進(jìn)行復(fù)制，從而在細(xì)胞內(nèi)建立新的噬菌體。這些病毒繼續(xù)復(fù)制，直到細(xì)菌細(xì)胞被裂解殺死，然后噬菌體后代逃離細(xì)胞，重新啟動(dòng)其他細(xì)菌的感染循環(huán)[10]。

圖1 肌病毒科噬菌體的結(jié)構(gòu)

2 噬菌體-抗菌藥物聯(lián)合使用

噬菌體與抗菌藥物兩者作用機(jī)制差異較大，聯(lián)合使用不僅可以產(chǎn)生更好的抑菌效果，而且可以有效抑制各自抗性菌的產(chǎn)生，達(dá)到較好的殺菌抑菌效果，為臨床治療多重耐藥的超級(jí)細(xì)菌，提供了一種可行的治療思路，具有極大的開發(fā)潛力?，F(xiàn)已有部分關(guān)于噬菌體聯(lián)合抗菌藥物在體內(nèi)或體外聯(lián)合使用對(duì)抗病原菌的研究（表1），筆者將聯(lián)合使用在不同細(xì)菌中的效果進(jìn)行總結(jié)。

表1 噬菌體-抗菌藥物聯(lián)合使用對(duì)抗病原菌的成功案例

2.1 銅綠假單胞菌 迄今為止，大多數(shù)噬菌體-抗菌藥物研究都集中在銅綠假單胞菌上，顯然是因?yàn)樗鳛闄C(jī)會(huì)性病原體具有重要的臨床影響，通常可導(dǎo)致囊性纖維化、燒傷感染、醫(yī)院獲得性肺炎、尿路感染等[18-19]。TkHilaishvili等[20]在2019年報(bào)道了1例多重耐藥銅綠假單胞菌假體關(guān)節(jié)感染和骨髓炎的患者，通過(guò)結(jié)合使用假體摘除、抗菌藥物間隔治療、全身抗菌藥物的使用以及留置引流管將噬菌體輸送到關(guān)節(jié)間隙成功治療感染，結(jié)果表明噬菌體-粘菌素的組合在體外對(duì)抑制銅綠假單胞菌生物膜形成具有協(xié)同作用。Torres-Barceló等[21]將噬菌體聯(lián)合不同種類、不同濃度的抗菌藥物對(duì)銅綠假單胞菌進(jìn)行了體外敏感性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示慶大霉素及甲氧芐啶與特異性噬菌體聯(lián)合治療具有顯著的協(xié)同效應(yīng)。Oechslin等[22]應(yīng)用心內(nèi)膜炎小鼠模型評(píng)估噬菌體聯(lián)合環(huán)丙沙星對(duì)銅綠假單胞菌的殺菌作用，同樣發(fā)現(xiàn)了明顯的協(xié)同效應(yīng)。Chan等[23]在應(yīng)用特異性噬菌體OMKO1聯(lián)合抗菌藥物治療1例多重耐藥銅綠假單胞菌引起主動(dòng)脈植入物感染患者的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，對(duì)噬菌體敏感的銅綠假單胞菌菌株對(duì)頭孢他啶與環(huán)丙沙星耐藥性高，而產(chǎn)生噬菌體抗性的菌株對(duì)頭孢他啶與環(huán)丙沙星恢復(fù)敏感，MIC值明顯降低。

2.2 大腸埃希菌 大腸埃希菌是一種在一定條件下可以引起人和多種動(dòng)物發(fā)生胃腸道、尿道、血液等多種感染的條件致病菌[24]。Huff等[25]用恩諾沙星（一種用于治療家畜的氟喹諾酮類抗菌藥物）與SPR02和DAF6噬菌體的混合物同時(shí)處理肉雞，拯救了所有實(shí)驗(yàn)感染禽致病性大腸埃希菌的肉雞。這一結(jié)果與單獨(dú)使用噬菌體或恩諾沙星有明顯差異，后者的病死率分別為15%和3%。

2.3 肺炎克雷伯菌 肺炎克雷伯菌是腸桿菌科克雷伯菌屬中非常重要的菌種之一，廣泛分布于自然界的水和土壤中，是人類鼻咽部和腸道常居菌，也是常見的條件致病菌，可引起人類肺炎、腦膜炎、泌尿系統(tǒng)感染、膿毒癥等各種感染性疾病，也是醫(yī)院感染的重要病原菌之一[26-27]。研究表明，與單獨(dú)用藥作用12 h的肺炎克雷伯菌成熟生物膜相比，噬菌體KPO1K2和環(huán)丙沙星的聯(lián)合使用抗生物膜作用無(wú)明顯差異，但聯(lián)合使用也沒有產(chǎn)生負(fù)面干擾，當(dāng)改用阿莫西林作為噬菌體的抗菌藥物補(bǔ)充劑時(shí)，抗生物膜效果顯著增強(qiáng)，表明β-內(nèi)酰胺類是該噬菌體類型的首選聯(lián)合藥物[12]。

2.4 金黃色葡萄球菌 金黃色葡萄球菌是一種重要的院內(nèi)感染病原菌，可導(dǎo)致血流感染、肺炎、心內(nèi)膜炎等危及生命安全的重癥感染[28]。Aslam等[29]報(bào)道了1例金黃色葡萄球菌引起的植入性左心室輔助裝置感染并發(fā)胸骨骨髓炎患者，在經(jīng)過(guò)反復(fù)清創(chuàng)及長(zhǎng)期抗菌藥物治療效果欠佳后，改為頭孢唑林、四環(huán)素聯(lián)合3種特異性噬菌體的靜脈治療，感染完全治愈且未復(fù)發(fā)。

3 噬菌體-抗菌藥物協(xié)同作用的可能機(jī)制

3.1 噬菌體-抗菌藥物的協(xié)同作用 噬菌體-抗菌藥物聯(lián)合使用的關(guān)鍵是兩者產(chǎn)生協(xié)同作用。噬菌體-抗菌藥物協(xié)同作用的定義是某些亞抑菌濃度的抗菌藥物可顯著刺激宿主細(xì)菌內(nèi)烈性噬菌體的產(chǎn)生，兩者聯(lián)用可發(fā)揮更好的抗菌活性現(xiàn)象[30-31]。Comeau等[4]研究發(fā)現(xiàn)在亞抑制濃度的β-內(nèi)酰胺和氟喹諾酮類藥物存在的情況下，較低的藥物暴露并沒有完全阻止大腸埃希菌細(xì)胞分裂，而是迫使細(xì)胞分裂不良，細(xì)胞壁變?nèi)?。這種改變的狀態(tài)導(dǎo)致了細(xì)胞絲化（細(xì)胞延長(zhǎng)但沒有分裂），這被認(rèn)為是通過(guò)一個(gè)簡(jiǎn)單的概念發(fā)揮作用的：與細(xì)胞絲化相關(guān)扭曲的生理狀態(tài)可以導(dǎo)致噬菌體生物合成能力的增加（即可用于促進(jìn)噬菌體組裝和成熟的前體增加），這一概念與β-內(nèi)酰胺類改變細(xì)胞壁的事實(shí)相結(jié)合，可能進(jìn)一步導(dǎo)致噬菌體裂解能力的增強(qiáng)效應(yīng)。

3.2 噬菌體-抗菌藥物對(duì)生物膜的清除作用 生物膜是指微生物為適應(yīng)周圍環(huán)境，黏附于有生命或無(wú)生命的介質(zhì)表面，并被其自身分泌的胞外基質(zhì)包裹而形成的一種緊密、穩(wěn)定、高度異質(zhì)的聚合三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[32]。細(xì)菌分泌的大量胞外聚合物使生物膜形成相對(duì)堅(jiān)固嚴(yán)實(shí)的結(jié)構(gòu)。研究表明，幾乎所有的細(xì)菌都可以形成生物膜[33]。噬菌體可產(chǎn)酶（如解聚酶、內(nèi)溶酶），促進(jìn)生物膜細(xì)胞外基質(zhì)的分解，這種作用亦可使生物膜中細(xì)菌更多地暴露在抗菌藥物的作用下，達(dá)到更好的殺菌效果[34]。此外，當(dāng)噬菌體產(chǎn)生的酶消滅了生物膜外部的細(xì)菌時(shí)，由于增加了氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的暴露，生物膜內(nèi)部細(xì)菌的新陳代謝會(huì)變得更加活躍，因此可能對(duì)噬菌體和抗菌藥物的作用更加敏感[35-36]。

3.3 噬菌體-抗菌藥物的“蹺蹺板效應(yīng)” 噬菌體對(duì)細(xì)菌菌株施加選擇壓力導(dǎo)致噬菌體抗性菌株的產(chǎn)生，噬菌體抗性菌株可能會(huì)發(fā)生適合度代價(jià)改變或重新獲得對(duì)抗菌藥物的敏感性，即“進(jìn)化權(quán)衡”-“蹺蹺板效應(yīng)”[37]。“進(jìn)化權(quán)衡”在生物學(xué)中常見，即細(xì)菌在一個(gè)性狀上表現(xiàn)出適應(yīng)能力提高的變化，而同時(shí)在另一個(gè)性狀上表現(xiàn)出性能下降。Ho等[38]研究中也發(fā)現(xiàn)了這種“進(jìn)化權(quán)衡”的現(xiàn)象，epaR基因的一個(gè)突變導(dǎo)致噬菌體對(duì)糞腸球菌的吸附減少；然而，這種基因改變導(dǎo)致了細(xì)菌對(duì)達(dá)托霉素的敏感性增加。有趣的是，這種“蹺蹺板效應(yīng)”也在金黃色葡萄球菌對(duì)β-內(nèi)酰胺和糖肽/脂肽藥物之間的敏感性中發(fā)現(xiàn)[17]。

4 噬菌體-抗菌藥物聯(lián)合使用潛在的缺陷

盡管噬菌體-抗菌藥物聯(lián)合使用在抗菌療效、降解生物被膜及防止耐受菌產(chǎn)生方面具有很大的潛力[39-40]，但其仍存在一些缺陷。首先，兩者聯(lián)合使用時(shí)細(xì)菌受到兩種不同的選擇壓力，產(chǎn)生抗菌藥物及噬菌體雙耐受株的問(wèn)題應(yīng)當(dāng)重視；其次，噬菌體優(yōu)先靶向于抗菌藥物敏感菌株，這樣可通過(guò)“競(jìng)爭(zhēng)性釋放”（在缺乏競(jìng)爭(zhēng)者而導(dǎo)致競(jìng)爭(zhēng)減弱時(shí)，物種會(huì)擴(kuò)展其實(shí)際生態(tài)位）促進(jìn)抗菌藥物耐受菌亞群的產(chǎn)生。根據(jù)這種假說(shuō)，先由抗菌藥物處理過(guò)的細(xì)菌擁有敏感的亞群，這些敏感的亞群優(yōu)先成為噬菌體的靶向目標(biāo)，從而間接促進(jìn)抗菌藥物耐受菌株的產(chǎn)生；最后，噬菌體和抗菌藥物可能通過(guò)群體感應(yīng)或“競(jìng)爭(zhēng)性釋放”獨(dú)立調(diào)節(jié)細(xì)菌的毒力，給治療帶來(lái)更糟糕的結(jié)果[41]。雖然目前還沒有大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)這些現(xiàn)象是聯(lián)合使用的重要障礙，但在臨床運(yùn)用時(shí)必須根據(jù)實(shí)際情況，“因地制宜、因時(shí)制宜、因人而異”，選擇合適的聯(lián)合使用方案，使治療效果達(dá)到最佳。

5 展望

目前，細(xì)菌對(duì)抗菌藥物產(chǎn)生的廣泛耐藥性及新型抗菌藥物研發(fā)滯緩迫使研究人員尋求新的策略來(lái)對(duì)抗耐藥菌株的出現(xiàn)。對(duì)噬菌體的研究結(jié)果表明，它們可以成為消除對(duì)人類和動(dòng)物構(gòu)成威脅病原體的另一種方法。目前，關(guān)于介導(dǎo)噬菌體與抗菌藥物之間協(xié)同作用的確切機(jī)制仍然不清晰。因此，到目前為止，仍然很難預(yù)測(cè)特定病原體的最佳噬菌體-抗菌藥物作用組合。然而，目前獲得的良好實(shí)驗(yàn)結(jié)果仍鼓勵(lì)繼續(xù)進(jìn)行噬菌體-抗菌藥物協(xié)同作用的研究，這很可能阻止現(xiàn)在面臨的耐藥時(shí)代，并在未來(lái)作為一種強(qiáng)有力對(duì)抗多重耐藥細(xì)菌的手段。雖然噬菌體的臨床廣泛應(yīng)用尚需時(shí)日，但在科技飛速發(fā)展的今天，相信很快就會(huì)找到解決問(wèn)題的鑰匙，開啟噬菌體臨床應(yīng)用的大門。

（本文由浙江省醫(yī)學(xué)會(huì)推薦）