賴婷婷 陳亮 張川 田鯤

牙釉質(zhì)作為最堅(jiān)硬、最精密的硬組織，其形成過程復(fù)雜，需基因表達(dá)，細(xì)胞分泌，蛋白及酶調(diào)控等共同作用，構(gòu)建從分子、納米至宏觀均高度有序的結(jié)構(gòu)。該過程最重要最基礎(chǔ)的是釉原蛋白發(fā)生一系列自組裝反應(yīng)形成納米球，搭建起釉質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)最基本的結(jié)構(gòu)實(shí)體，再進(jìn)一步聚集成高級(jí)構(gòu)象作為有機(jī)模板，指導(dǎo)羥基磷灰石晶體有序地成核與伸長(zhǎng)[1]。釉原蛋白(amelogenin)是釉質(zhì)形成初期最主要的細(xì)胞外基質(zhì)，占90%[1]，在體外能自組裝成直徑16～70 nm的納米球[2]。通過原子力顯微鏡[3]、小角度X線散射(SAXS)[4]、核磁共振[5]、動(dòng)態(tài)光散射(DLS)和透射電子顯微鏡(TEM)[6]等的研究，納米球結(jié)構(gòu)已被廣泛認(rèn)可。隨著牙釉質(zhì)礦化成熟，釉原蛋白逐漸降解、消失，即表現(xiàn)為在牙胚發(fā)育早期高度表達(dá)，晚期及已礦化期低表達(dá)甚至無(wú)表達(dá)。

釉原蛋白的自組裝過程發(fā)生在水性環(huán)境中，若進(jìn)行常規(guī)脫水會(huì)導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)明顯改變。冷凍電子顯微鏡能將蛋白樣品迅速冷卻至玻璃態(tài)冰[7]，鏡下結(jié)構(gòu)基本反映冷卻前的瞬時(shí)狀態(tài)，最大程度減少了脫水偽影，且需要的樣品量少[7]。因此，本實(shí)驗(yàn)采用冷凍電子顯微鏡來觀察人釉原蛋白在體外的自組裝過程，初步探究釉原蛋白的自組裝機(jī)制，為體外修復(fù)缺損釉質(zhì)提供思路。

1 材料與方法

完整取出青少年下頜第三磨牙牙囊(處于釉質(zhì)發(fā)育期)1 例(四川省人民醫(yī)院口腔正畸科)， InvitrogenTMTRIZOL?試劑(賽默飛世爾，美國(guó))提取牙胚細(xì)胞總RNA,根據(jù) Gen Bank 公布的人釉原蛋白全長(zhǎng)序列(Genebank M86932)，利用 Primer Premier 5 生物學(xué)軟件分析并設(shè)計(jì)特異性引物，引入酶切位點(diǎn) Bam H I 和 Sac I。引物由上海生工生物公司合成，引物序列如表 1，劃線為酶切位點(diǎn)。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA鏈,通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增釉原蛋白基因全長(zhǎng)序列，并回收、克隆、篩選及鑒定(圖 1)。與pMD19-T原核表達(dá)載體構(gòu)建重組質(zhì)粒，采用過熱激法再將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入原核表達(dá)菌株宿主菌E.coliTop10 中培養(yǎng)(圖 2)，A600值為0.6時(shí)，以0.3 mmol/L異丙基-β- D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)、純化，電泳檢測(cè)(圖 3)。透析法調(diào)pH為3.5，冷凍干燥保存。

在冰上用pH為3.5的超純水溶解釉原蛋白凍干粉， 4 ℃放置24 h，確保蛋白質(zhì)完全溶解。滴入4 mmol/L pH=8.0的PBS液，使蛋白液pH值從3.5躍升至8.0，蛋白最終質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL。在自組裝發(fā)生1、 10、 20 min 時(shí)終止反應(yīng)，觀察組裝情況。將20～50 μL的蛋白溶液滴至銅網(wǎng)多孔碳側(cè)，凍干后將銅網(wǎng)置于cryo TEM(Tecnai F20 TEM型，F(xiàn)EI公司，美國(guó))下觀察。

表 1 釉原蛋白全長(zhǎng)引物

M: MD2000 Marker; AM:人釉原蛋白

2 結(jié) 果

冷凍電子顯微鏡觀察人釉原蛋白在1、 10、 20 min 的自組裝狀態(tài)(圖 4)。當(dāng)pH從3.5迅速提升至8，隨時(shí)間遞增，蛋白形態(tài)、結(jié)構(gòu)逐漸變化：由最初的低聚體到納米小球，最終形成網(wǎng)狀蛋白框架鏈。該過程是復(fù)雜、循序漸進(jìn)的，兩個(gè)單體疊加成二聚體，進(jìn)一步團(tuán)聚成六聚體，八聚體等大小不同形狀不同的團(tuán)聚物[8]。

M: MD2000 Marker; 1: pMD19-T-Am PCR產(chǎn)物

M： Protein maker; 1： 無(wú) IPTG(None IPTG); 2： 0.1 mmol/L IPTG; 3： 0.2 mmol/L IPTG; 4： 0.3 mmol/L IPTG; 5： 0.4 mmol/L IPTG; 6、 7： 誘導(dǎo)前(Before induction); 8、 9： 0.3 mmol/L IPTG誘導(dǎo)后(after 0.3 mmol/L IPTG induction)

隨著聚集體數(shù)目的增加、相互融合，出現(xiàn)更大分子量的多聚體與納米球，而納米球串聯(lián)形成納米帶，納米帶縱橫交錯(cuò)形成大面積的網(wǎng)狀蛋白支架。在1 min時(shí)主要觀察到蛋白分子的低級(jí)結(jié)構(gòu)——低聚體(圖 4左)。蛋白的組裝并非同時(shí)進(jìn)行，同一視野既有單個(gè)小體積球體(圖 5A)，也有L型(圖 5B)、蝴蝶夾狀(圖 5C)的四聚體等，體積均相對(duì)較小，最長(zhǎng)軸直徑 10～40 nm不等，此時(shí)發(fā)生自組裝的蛋白也較少。10 min時(shí)自組裝蛋白明顯增多，體積增大(圖 4中)，低聚體出現(xiàn)環(huán)狀或縱向延伸，呈花瓣?duì)?圖 5D、 5E)、帶狀(圖 5F),同時(shí)出現(xiàn)較多的納米球，約20～30 mm(圖 5G)，甚至聚集成直徑約80 nm的巨大的蛋白分子(圖 5H)。 20 min時(shí)，蛋白的組裝趨于成熟，小體積的多聚體較少，蛋白在空間三維方向上的延伸明顯(圖 4右),有類似錐體型的結(jié)構(gòu)(圖 5I)，體積明顯變大，形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(圖 5J)。

圖 4 釉原蛋白的自組裝過程

1 min(A: 小體積球體; B： L型四聚體； C： 蝴蝶夾狀的四聚體； D： 小花瓣?duì)?; 10 min(E：大花瓣?duì)睿?F： 帶狀； G： 納米球； H： 不規(guī)則巨大蛋白分子); 20 min(I： 錐體型； J： 蛋白網(wǎng))

3 討 論

釉原蛋白的結(jié)構(gòu)與功能緊密協(xié)作、不可分割。人釉原蛋白由三個(gè)不同亞單位組成：N 端具有45 個(gè)氨基酸，酪氨酸的含量高，又稱TRAP (tyrosine-rich amelogenin peptide)；中央段具有疏水性，由Xxx-Yyy-Pro重復(fù)序列構(gòu)成(X和Y主要是谷氨酰胺；P，脯氨酸)，變異性大，不同物種氨基酸序列重復(fù)單元長(zhǎng)度不同；C 端較短，具有親水性，富含亮氨酸。Fukae等[9]提出核-殼模型：中性的N端和中央段形成納米球的致密核心，負(fù)極域(C端)暴露于溶液中，形成疏松帶負(fù)電荷的殼。適宜條件下，負(fù)電荷殼產(chǎn)生排斥力防止納米球之間相互聚集，調(diào)節(jié)納米球大小。此外，C端還參與羥基磷灰石表面的附著，而N端和中央段主要影響蛋白質(zhì)之間的相互作用[10]。釉原蛋白的親疏水性，使其在生理?xiàng)l件下微溶于水，呈固態(tài)或半固態(tài)，易聚集形成團(tuán)聚物，也為自組裝創(chuàng)造了條件。釉原蛋白轉(zhuǎn)錄時(shí)還可出現(xiàn)RNA 的選擇性剪切，產(chǎn)生富含主要功能區(qū)的異構(gòu)體蛋白片段——LRAP(leucine-rich amelogenin peptide)，其也可自發(fā)組裝成納米球[11]。

釉原蛋白作為釉質(zhì)形成過程中主要的功能性蛋白，屬于內(nèi)在無(wú)序化結(jié)構(gòu)蛋白(intrinsically disordered/unstructured protein family，IDPs)。Goto等[12]研究豬的釉原蛋白認(rèn)為不同蛋白區(qū)域有相應(yīng)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，N端 (TRAP) 為 β-sheet；中央段富含展開的聚脯氨酸 II 或 β-turn，如 β- 螺旋；C 末端為不規(guī)則螺旋。IDPs構(gòu)象不穩(wěn)定，常以非折疊狀態(tài)存在，與不同分子相互作用時(shí)轉(zhuǎn)變不同的結(jié)構(gòu)，適宜條件時(shí)趨于自組裝成納米球，可以解釋圖中觀察到的大小不等、形態(tài)各異的低聚體、多聚體等。釉原蛋白的自組裝受多種因素影響， 包括蛋白質(zhì)濃度，溫度，pH和離子強(qiáng)度等[13]。本實(shí)驗(yàn)最先觀察到是直徑約10 nm的低聚體(圖 3A)，與實(shí)驗(yàn)[14]提到的3～10 mm大小一致。但未見明顯的單體——直徑小于3 nm的細(xì)長(zhǎng)結(jié)構(gòu)，猜測(cè)釉原蛋白強(qiáng)烈依賴pH，當(dāng)pH從3躍升至8，觸發(fā)了釉原蛋白構(gòu)象從無(wú)序狀態(tài)到折疊狀態(tài)，自組裝開始，單體迅速消耗聚集成低聚體。低pH時(shí)易觀察到單體，如pH=4.4,單體及單體鏈占主體[13]，在酸性溶液中單體呈不對(duì)稱的狹長(zhǎng)桿狀或橢圓形[15]；低聚體形成后由釉原蛋白N段誘導(dǎo)，中央段通過質(zhì)子化作用參與納米球的形成，C端對(duì)聚合反應(yīng)的作用較小，主要抑制聚合體尺寸過大[16-17]。納米球形成后，表面暴露多個(gè)氨基酸序列(如 ATMP 模體：PYPSYGYEPMGGW)，由于該實(shí)驗(yàn)中缺少非釉原蛋白等物質(zhì)，不能進(jìn)一步組裝成超分子集團(tuán)[18]，納米球大小僅20～30 mm?，F(xiàn)暫無(wú)足夠證據(jù)表明納米球形態(tài)為扁圓形或球形，但傾向于納米球不是均質(zhì)的,是低聚體圍繞球體空心性排列，呈甜甜圈狀[3，19]。本實(shí)驗(yàn)圖3 DE可能是低聚體正環(huán)聚成納米球的過程。 20 min時(shí)觀察到的網(wǎng)狀蛋白鏈(圖3J)為非典型的單一軸向蛋白鏈，因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)中蛋白濃度足夠(0.1 mg/ml)，溶液中任一空間點(diǎn)均可發(fā)生自組裝，同時(shí)由于缺乏非釉原蛋白，如成釉蛋白(ameloblastin)，釉蛋白(enamelin)，蛋白酶以及生長(zhǎng)因子類物質(zhì)等的參與，無(wú)法完全模擬體內(nèi)自組裝環(huán)境，最終呈現(xiàn)出較散亂的鏈狀結(jié)構(gòu)。當(dāng)然，冷凍電子顯微鏡是對(duì)三維結(jié)構(gòu)的二維投射，觀察到的平面結(jié)構(gòu)可能與真實(shí)結(jié)構(gòu)存在偏差，若需驗(yàn)證低聚物、納米球、蛋白鏈確切的空間結(jié)構(gòu)及功能，有待進(jìn)一步探索。

雖然釉原蛋白的自組裝過程已基本達(dá)成共識(shí)，Moradianoldak實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)[20],納米球并非剛性結(jié)構(gòu)，吸附在不同疏水性或不同電荷的表面會(huì)解組裝，猜測(cè)最終是低聚體亞基在釉原蛋白-礦物質(zhì)接觸面發(fā)揮作用，低聚體才是誘導(dǎo)釉質(zhì)形成的功能實(shí)體。體外已很好地證明了釉原蛋白的逐步分級(jí)自組裝，而體內(nèi)是相當(dāng)復(fù)雜的過程，需綜合考慮礦物質(zhì)、其他蛋白質(zhì)、分子間親疏水性等影響裝配過程的各因素?，F(xiàn)如今，牙釉質(zhì)的仿生礦化被廣泛研究，除釉原蛋白外，有多肽、細(xì)胞外基質(zhì)類似物、聚酰胺-胺型樹枝狀分子及殼聚糖等不斷被提出[21]，但進(jìn)一步弄清釉原蛋白自組裝機(jī)制及功能實(shí)體，才是研究新材料及開發(fā)新療法修復(fù)和再生牙體硬組織的基礎(chǔ)與關(guān)鍵。