翁丹楓，傅曉丹，陳淑惠，張真真

骨腫瘤病理大切片可以觀察組織全貌，準(zhǔn)確評(píng)估病灶大小、侵襲范圍以及手術(shù)切緣，對(duì)于確定骨腫瘤的邊界和臨床預(yù)后非常重要。但骨組織中豐富的鈣鹽導(dǎo)致完整制片困難，尤其是大切片的制作。普通酸性脫鈣液因破壞細(xì)胞及組織結(jié)構(gòu)，影響染色、鏡下觀察和分子檢測(cè)，已不適用于日常工作，而EDTA脫鈣液性質(zhì)溫和，能有效保護(hù)組織內(nèi)的核酸和組織抗原，日益成為骨標(biāo)本處理的首選[1-2]。本科室將EDTA脫鈣液應(yīng)用于骨組織大切片制片及染色過程，總結(jié)了骨組織大切片的制作方法，以期在臨床骨病變標(biāo)本的處理中推廣應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑鋸骨機(jī)(昊鷹HYTW-300)，脫水機(jī)(Thermo Pathcenter)，多功能染色機(jī)(Leica ST5020)，磁力攪拌器(博大HMS-901)，恒溫?fù)u床(南榮NRY-100C)，平推式切片機(jī)(REM-710，大和公司)，10%中性福爾馬林，不銹鋼包埋模具(6.5 cm×4.5 cm)、包埋脫水盒(6.5 cm×4.5 cm×1.0 cm)，載玻片(5.5 cm×5.1 cm)(圖1)，蓋玻片(5.5 cm×4.8 cm)。20%EDTA脫鈣液的配制：取乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na，購自上海瀘試化工公司，貨號(hào)6381-92-6)250 g于燒杯中，倒入磷酸鹽緩沖液至總體積1 000 mL；置于磁力攪拌器37 ℃恒溫?cái)嚢?，加?5 g氫氧化鈉繼續(xù)攪拌至完全溶解；測(cè)pH值為7.2～7.6。

1.2 取材與固定選取福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科接收的股骨頭壞死和骨腫瘤標(biāo)本20例，將骨組織標(biāo)本用鋸骨機(jī)沿著矢狀面最大切面鋸開，鋸成大小4 cm×6 cm、2～8 mm厚的骨薄片，用10%中性福爾馬林室溫下固定24～48 h。

1.3 脫鈣固定好的骨組織切片完全浸沒于20%EDTA脫鈣液中，置于37 ℃恒溫?fù)u床(HNY-100B，長(zhǎng)沙巴躍儀器公司)，以60 r/min勻速緩慢搖動(dòng)，期間每隔2天換脫鈣液，直至尖鑷較易刺入骨組織為脫鈣完成。

1.4 脫水與包埋將脫鈣后的骨組織放入大組織專用脫水機(jī)，針對(duì)不同厚度的組織選用相應(yīng)的脫水程序(表1)，2～5 mm厚組織脫水時(shí)間為17 h，5～8 mm厚組織脫水時(shí)間為27 h。經(jīng)58～60 ℃硬蠟包埋，包埋時(shí)將組織放在包埋框模具中，先向蠟槽加入一半石蠟，將組織放入蠟槽內(nèi)，盡量居中壓平，輕力按壓一段時(shí)間后，蓋上包埋盒并灌加石蠟包埋，即制作成大蠟塊。

表1 骨大組織脫水流程中透明和浸蠟的時(shí)間

1.5 切片蠟塊整修后放入平推式滑動(dòng)切片機(jī)上5～7 μm厚切片，45°角進(jìn)刀。切片機(jī)可裝2個(gè)刀片，先用廢棄舊刀片修去表面余蠟，再換新刀片切出蠟片，要求切片厚度均勻，組織完整。因骨組織比較脆硬，切片時(shí)要緩慢、力度均勻，配上加濕器可使組織濕潤(rùn)不易出現(xiàn)脆裂現(xiàn)象。經(jīng)37 ℃蒸餾水和45 ℃溫水2次展片，攤片時(shí)應(yīng)小心、輕柔且動(dòng)作迅速，然后把蠟片撈于大載玻片上，瀝水晾干2 h后70 ℃烤片20～30 min，以防止染色過程中脫片。

1.6 HE染色將玻片斜插于染色架上(圖2)，后直接放入Leica ST5020全自動(dòng)染色機(jī)中進(jìn)行HE染色。

1.7 Masson染色切片脫蠟水洗，入鐵蘇木精5～10 min，0.5%鹽酸分化，流水至藍(lán)化，入酸性品紅5～10 min，磷鉬酸分化3～5 min，置于甲苯胺藍(lán)1 min，傾去染液，用1%冰醋酸洗，最后脫水、透明、封固。

①②

1.8 免疫組化采用免疫組化EnVision兩步法檢測(cè)CK、EMA和Ki-67在股骨頸大切片轉(zhuǎn)移癌中的表達(dá)，抗體及試劑盒均購自福州邁新公司，一抗工作濃度為1 ∶100，具體操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。

2 結(jié)果

骨組織7～10天脫鈣完成，經(jīng)EDTA脫鈣后的骨組織脫鈣充分，軟硬適中，完全脫水，切片完整。HE染色顯示：股骨頭壞死(圖3A、B)和硬化型骨肉瘤(圖3C)大切片HE著色均勻，組織完整無鈣鹽殘余，無脫落和皺縮。骨肉瘤和股骨頭壞死灶內(nèi)細(xì)微結(jié)構(gòu)：包括藍(lán)色幼稚骨組織(圖4A)，紅色股骨頭壞死，藍(lán)色壞死周圍膠原(圖4B)，肉芽組織背景中微血管增生(圖4C)，提示大切片Masson染色有助于幼稚骨樣組織的識(shí)別、股骨頭壞死灶影像及病理的對(duì)比觀察和各種物質(zhì)的量化評(píng)估。股骨頭轉(zhuǎn)移癌大組織切片免疫組化結(jié)果顯示：EDTA脫鈣對(duì)癌組織EMA(圖5A)、CK(圖5B)和Ki-67(圖5C)在染色強(qiáng)度和范圍無顯著影響，提示EDTA脫鈣大組織切片有助于保持細(xì)胞胞膜、胞質(zhì)及胞核的抗原。

3 討論

骨大組織切片可以突破小切片的局限性，能夠在同一張切片中觀察整個(gè)骨病變的細(xì)微結(jié)構(gòu)，完整顯示骨質(zhì)破壞的范圍和程度，反映骨組織周圍軟組織的變化，整體性強(qiáng)，有利于骨病變的病理診斷及預(yù)后判斷。但是前期骨標(biāo)本脫鈣是骨組織大切片制作的難點(diǎn)和關(guān)鍵。EDTA是一種優(yōu)良的脫鈣螯合劑，其脫鈣作用優(yōu)于酸性溶液，對(duì)組織破壞極小，能保持組織細(xì)胞的完整結(jié)構(gòu)，尤其細(xì)胞顯微化學(xué)改變甚微，且能保存組織中抗原物質(zhì)的活性，在免疫組化方面具有較大優(yōu)勢(shì)[2]。研究表明EDTA脫鈣液用于大鼠脛骨組織脫鈣時(shí)間需3周以上[3]，無法滿足臨床快速診斷需要。適當(dāng)提高EDTA脫鈣液濃度和溫度能夠縮短脫鈣的時(shí)間[4-5]，因此我們采用濃度為20%EDTA脫鈣液，并且脫鈣過程始終在37 ℃恒溫?fù)u床中進(jìn)行，通過恒溫加熱及震蕩加速脫鈣液滲入組織。結(jié)果表明，脫鈣時(shí)間縮短至1周，節(jié)省了脫鈣時(shí)間并提高工作效率，且HE、Masson和免疫組化染色結(jié)果顯示其對(duì)骨大組織細(xì)微結(jié)構(gòu)及組織內(nèi)酶類和抗原保存良好。

本組通過多次實(shí)驗(yàn)摸索，總結(jié)EDTA脫鈣制備骨病變大切片的方法：(1)骨組織大切片的取材厚度2～3 mm為佳，太厚則影響組織的固定、脫鈣和脫水效果，太薄組織經(jīng)脫水和浸蠟后易變形，包埋時(shí)組織不平整，切面不完整，較難完整制片；(2)組織固定、脫鈣和脫水時(shí)間要充足，為確保骨組織充分脫鈣和脫水，脫鈣液每隔1天要更換，組織脫水處理所用試劑須根據(jù)使用情況及時(shí)更新，保持有效濃度，脫水完全可以防止掉片；(3)脫鈣完成后經(jīng)流水沖洗15 min，防止殘余EDTA在乙醇和組織中沉淀，影響組織染色；(4)浸蠟溫度以62～65 ℃為宜，建議用熔點(diǎn)為58～60 ℃的硬蠟，溫度太高會(huì)使組織細(xì)胞變形變脆，核皺縮，切片易皺縮脫落，組織塊容易龜裂；而溫度太低則影響液態(tài)石蠟向組織的浸透，組織浸蠟不充分影響切片；(5)包埋要平整，對(duì)組織翹起部分，可使用按壓工具，待底層石蠟?zāi)毯螅p輕蓋上包埋盒再灌注石蠟，可防止氣泡，包埋時(shí)的冷凍時(shí)間也需要嚴(yán)格控制，凍至蠟塊表面發(fā)白后轉(zhuǎn)移至常溫放置；(6)切片時(shí)要?jiǎng)蛩龠M(jìn)刀，過快或過慢刀口均容易卡住蠟塊，且不需要冷凍蠟塊，但需要使用加濕器消除靜電[6]，切片后室溫晾干1 h以上，再放入烤箱70 ℃烤片30 min再行后續(xù)染色；(7)行特殊染色和免疫組化染色時(shí)需制作上膠片：普通載玻片涂沫粘附劑如多聚賴氨酸或APES稀釋后用丙酮浸泡，再過乙醇、蒸餾水，最后烤干待用，可防止掉片。

③A③B③C④A④B④C⑤A⑤B⑤C

綜上所述，在37 ℃下20%EDTA脫鈣用于制作骨大組織切片的方法簡(jiǎn)便易行，耗時(shí)短，且染色符合形態(tài)學(xué)觀察要求，適用于臨床和科研對(duì)骨組織大標(biāo)本的形態(tài)學(xué)觀察、影像學(xué)比對(duì)、骨腫瘤化療效果、骨壞死程度和范圍的評(píng)估，為骨病變的分子檢測(cè)奠定基礎(chǔ)，值得推廣使用。