尹德晶， 陳 靜， 楊 鵬， 謝曉東， 李喬斌， 程振濤，2， 王開功，2*， 岳 筠

(1. 貴州大學動物科學學院，貴州 貴陽 550025； 2. 貴州省動物疫病預防控制中心，貴州 貴陽 550008)

2020年9月12日，貴州省安順市某養(yǎng)殖場育肥牛出現(xiàn)不明原因的死亡病例，臨床癥狀及病理變化與牛支原體、血液原蟲感染相似。為確診病因，采集相關病料進行實驗室檢測，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 病料采集該養(yǎng)殖場病死牛的肺臟、肝臟、腎臟、心臟、脾臟，以及病牛耳靜脈血作為檢測病料。

1.2 主要試劑姬姆薩染液(購自上海索萊寶生物科技有限公司)；DNA提取試劑盒、Maker DL 2 000、2×TaqPCR Master Mix(購自TaKaRa公司)；鮮血營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(自備)。

1.3 主要儀器T20型雙槽梯度PCR儀(購自杭州朗基科學儀器有限公司)；Tanon1600全自動數(shù)碼凝膠成像系統(tǒng)(購自上海天能公司)；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋(購自常州金壇良友儀器有限公司)；OLYMPUS生物顯微鏡(型號CX33，購自上海普赫光電科技有限公司)。

1.4 臨床癥狀和病理變化觀察對養(yǎng)殖場發(fā)病情況進行調(diào)查，觀察病牛臨床癥狀，對病死牛進行剖檢觀察病理變化。

1.5 牛支原體核酸檢測取肺臟組織，加入適量PBS，研磨均勻，離心提取上清。采用DNA試劑盒提取總DNA，針對牛支原體標準株PG45(GenBank登錄號：KP229483.1)的TU基因設計1對特異性引物(5’-GCTCAAGCAGGTGACAACGCAG-3’；5’-TCC AACTGTTCTACCACCTTCACGG-3’)，預擴增片段351 bp。PCR擴增體系25 μL：2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，DNA模板2 μL，上、下游引物(10 pmol/μL) 各1 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性45 s，52 ℃退火40 s，72 ℃延伸80 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。產(chǎn)物通過1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.6 血液原蟲檢查取病牛耳靜脈血制成血涂片，經(jīng)甲醇固定，姬姆薩染色，10×100倍顯微鏡觀察。

1.7 細菌分離培養(yǎng)無菌操作取病死牛的肝臟、腎臟、心臟、脾臟組織，分別接種于鮮血營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h觀察結果。

2 結果

2.1 臨床癥狀及病理變化病牛消瘦，被毛粗亂，體溫升高至41 ℃，食欲廢絕，腹部膨大，站立困難。病理剖檢顯示肺部炎癥和壞死灶。

2.2 牛支原體核酸檢測結果檢測樣品擴增出351 bp 目的條帶(見圖1)，牛支原體核酸檢測結果為陽性，提示存在牛支原體感染。

M：2 000 bp分子質(zhì)量標準； -：陰性對照； 1：檢測樣品； +：陽性對照圖1 牛支原體PCR檢測結果

2.3 血液原蟲檢查結果血涂片鏡檢可見大量的紅細胞變形為齒輪狀、星芒狀(見圖2)，提示存在附紅細胞體感染。未發(fā)現(xiàn)其他血液寄生蟲感染。

圖2 血液原蟲檢測結果

2.4 細菌分離培養(yǎng)結果接種肝臟、脾臟、心臟、腎臟的鮮血瓊脂培養(yǎng)基上未見菌落生長，提示無細菌感染。

3 結論

通過臨床癥狀、病理變化、支原體核酸檢測、血液原蟲檢查和細菌分離培養(yǎng)，確診病例為牛支原體與附紅細胞體混合感染。

4 討論

4.1牛支原體(Mycoplasmabovis)是1種沒有細胞壁的原核生物，感染牛可發(fā)生乳腺炎、肺炎、關節(jié)炎、角膜結膜炎、中耳炎等，特別是犢牛肺炎和成年母牛乳腺炎[1]。附紅細胞體(Eperythrozoon)是1種血液寄生原蟲，可附著在紅細胞表面或游離于血漿中，沒有嚴格的宿主選擇性，可感染人、牛、豬、羊等多種動物；病牛體溫升高至40～41.5 ℃，呈稽留熱，流清鼻涕，呼吸急促，嚴重貧血，皮膚及可視黏膜蒼白或黃疸，四肢無力，步態(tài)不穩(wěn)，喜臥，少數(shù)出現(xiàn)血尿等臨床癥狀[2]。附紅細胞體在分類學上曾被歸屬于立克次氏體，但周作勇等[3]經(jīng)過基因序列分析比對發(fā)現(xiàn)其與支原體的同源性更高，種屬關系更為接近。近年來豬、羊、牛支原體和附紅細胞體的混合感染均有報道，這2種病原感染前期常呈隱性，不易發(fā)現(xiàn)病情，病程緩慢，但混合感染的致病力增強，診治難度增加，對我國養(yǎng)殖業(yè)的危害甚大[4～6]。

4.2牛支原體肺炎多與應激和環(huán)境衛(wèi)生有關，主要通過疫苗接種進行防控。防治附紅細胞體病主要通過加強飼養(yǎng)管理、控制和消滅蜱等傳播媒介、定期驅蟲以減少該病的傳播，規(guī)?；B(yǎng)殖場應做好定期監(jiān)測并建立完善的養(yǎng)殖、防疫制度。