楊 鵬， 陳 靜， 尹德晶， 謝曉東， 李喬斌， 岳 筠， 程振濤*

(1. 貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025； 2. 貴州省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，貴州 貴陽 550008)

近年來，隨著我省生豬養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大和流通調(diào)運(yùn)日益頻繁，豬病的發(fā)生也越來越復(fù)雜，特別是豬繁殖與呼吸綜合征、豬瘟、豬圓環(huán)病毒病、豬偽狂犬病等多種病毒性疫病已成為危害養(yǎng)豬業(yè)的重要疫病，且常發(fā)生多病原混合感染。2020年9月，貴州省興義市某生豬養(yǎng)殖場出現(xiàn)不明原因死亡病例，通過臨床癥狀觀察，懷疑存在多病原混合感染，特采集病料進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室病原學(xué)檢查診斷，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 病料采集該養(yǎng)豬場3頭病死豬的腦、肺臟、腎臟、脾臟、肝臟、淋巴結(jié)及病豬耳靜脈血作為檢測病料。

1.2 主要試劑姬姆薩染色試劑盒(購自天根生物試劑公司)；豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)通用型實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測試劑盒、豬瘟病毒(CSFV)通用型實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測試劑盒、豬偽狂犬病病毒(PRV)通用型實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測試劑盒、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)普通PCR檢測試劑盒(購自北京世紀(jì)元亨公司)；DNA/RNA提取試劑盒、DL 2 000 DNA Marker 試劑(購自大連寶生物工程有限公司)；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 主要儀器T20型雙槽梯度PCR儀(購自杭州朗基科學(xué)儀器有限公司)；Tanon1600全自動(dòng)數(shù)碼凝膠成像系統(tǒng)(購自上海天能公司)；FQD-96A型熒光定量PCR儀(購自杭州博日科技有限公司)。

1.4 血液原蟲檢查病豬耳靜脈血制作血涂片，姬姆薩染色，10×100倍顯微鏡下觀察。

1.5 相關(guān)病毒核酸檢測取腦、肺臟、腎臟、脾臟、肝臟、淋巴結(jié)組織進(jìn)行混合勻漿，反復(fù)凍融3次，4 ℃ 12 000 r/min 離心10 min，取上清液100 μL，用DNA/RNA試劑盒提取總DNA/RNA。以此總DNA/RNA為模板，分別應(yīng)用PRRSV通用型實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測試劑盒(判定標(biāo)準(zhǔn)：陽性對照Cq值≤30并出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線，陰性對照無Cq值并且無特異性擴(kuò)增曲線，實(shí)驗(yàn)結(jié)果成立；被檢樣品Cq值≤30并出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線為PRRSV陽性；被檢樣品30

2 結(jié)果

2.1 血液原蟲檢查由圖1可見：血液樣品鏡檢可見紅細(xì)胞變形呈齒輪狀、星芒狀等形態(tài)，提示存在附紅細(xì)胞體感染。未見其他血液寄生蟲感染。

圖1 3份血涂片檢查結(jié)果

2.2 PRRSV核酸檢測由圖2可見：陽性對照Cq值為27，陰性對照無Cq值且無特定擴(kuò)增曲線。3份檢測樣品均無Cq值且均未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，提示組織樣品中不存在PRRSV感染。

+：陽性對照； -：陰性對照； 1～3：檢測樣品圖2 PRRSV實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測結(jié)果

2.3 CSFV核酸檢測由圖3可見：陽性對照Cq值為10，陰性對照無Cq值且無特定擴(kuò)增曲線。3份檢測樣品Cq值分別為34、34、32，且有特定擴(kuò)增曲線，提示組織樣品中存在CSFV感染。

+：陽性對照； -：陰性對照； 1～3：檢測樣品圖3 CSFV實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測結(jié)果

2.4 PRV核酸檢測由圖4可見：陽性對照Cq值為29，陰性對照無Cq值且無特定擴(kuò)增曲線。3份檢測樣品均無Cq值且均未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，提示組織樣品中不存在PRV感染。

+：陽性對照； -：陰性對照； 1～3：檢測樣品圖4 PRV實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測結(jié)果

2.5 PCV2核酸檢測由圖5可見：3份檢測樣品PCR均擴(kuò)增出353 bp目的基因片段，與陽性對照片段相同，提示組織樣品中存在PCV2感染。

M：2 000 bp分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； +：陽性對照； -：陰性對照； 1～3：檢測樣品圖5 PCV2 PCR檢測結(jié)果

3 結(jié)論

通過相關(guān)病毒核酸檢測和血液原蟲檢查，確診豬場病例存在豬瘟病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬附紅細(xì)胞體混合感染。

4 討論

4.1豬瘟病毒和圓環(huán)病毒2型均可引起豬群發(fā)生嚴(yán)重的原發(fā)性感染，并導(dǎo)致感染豬的免疫抑制，引起其他病原的繼發(fā)或混合感染[1]。近年來關(guān)于豬瘟病毒和豬圓環(huán)病毒2 型等多病原混合感染的報(bào)道較多，給豬場造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[2～5]。目前，關(guān)于豬瘟和豬圓環(huán)病毒病的防控主要依靠疫苗免疫，科學(xué)的免疫程序是預(yù)防疫病的關(guān)鍵[6]。疫病的發(fā)生通常與豬場的衛(wèi)生條件差、消毒制度不嚴(yán)格、疫苗免疫失敗等有關(guān)[7]。

4.2附紅細(xì)胞體病是由附紅細(xì)胞體寄生于動(dòng)物血液、組織液及腦脊液中引起的1種原蟲病，豬、牛、羊等動(dòng)物均可感染[8～10]。近年來豬附紅細(xì)胞體病已成為豬的常見病和多發(fā)病，一年四季均可發(fā)生，不同日齡、品種的豬均易感染，且感染率和發(fā)病率都很高，并多與其他疫病混合感染，造成診斷和治療的難度增加[11]。預(yù)防本病要做好豬舍的環(huán)境衛(wèi)生，定期驅(qū)蟲，殺滅蚊、蠅、虱以切斷傳播途徑[12]。