趙 超， 張啟琴， 陳 靜， 尹德晶， 肖 麗， 吳斌鳳， 胡 茜， 劉 婷， 郭小江， 程振濤，2*

(1. 貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025； 2. 貴州省動物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點實驗室，貴州 貴陽 550025； 3. 貴州省草地技術(shù)實驗推廣站，貴州 貴陽 550025)

雞傳染性喉氣管炎(Avian infectious laryngotracheitis，AILT) 是由傳染性喉氣管炎病毒 (Infectious laryngotracheitis virus，ILTV) 引起雞的1種急性、高度接觸性傳染病[1]。我國于20世紀(jì)50年代末期首次報道有該病發(fā)生，90年代后在我國一些地區(qū)呈地方流行性[2]。其感染后主要侵害雞的上呼吸道，發(fā)病率高，傳播速度快，給我國的養(yǎng)雞業(yè)造成很大損失。ILTV 屬于皰疹病毒科，α-皰疹病毒亞科，禽皰疹病毒Ⅰ 型，是二十面體對稱的雙鏈DNA病毒；gD基因是該病毒的主要糖蛋白基因，對于病毒的吸附及侵入是必需的，也是病毒繁殖的必需基因，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答[3]。本試驗對在貴州省開陽縣某養(yǎng)雞場分離的ILTV貴州株gD基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增、克隆、序列及遺傳進(jìn)化分析，以了解該毒株的遺傳進(jìn)化情況，為防控疫苗選擇提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料采集貴州省開陽縣某養(yǎng)雞場ILTV感染雞喉頭和氣管樣品4份。

1.2 主要試劑DNA提取試劑盒、DL 2 000 DNA Marker、2×TaqPCR Master Mix、pMD-18T載體試劑、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、HindⅢ(購自大連寶生物工程有限公司)；質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒(購自O(shè)mega公司)；大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α(貴州大學(xué)動物疫病研究所制備并保存)；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 主要儀器凝膠成像儀(購自天能科技有限公司)、多功能梯度PCR儀VeritiTM96-Well Thermai(購自美國ABI公司)、DYY-8C型電泳儀器電源(購自北京市六一儀器廠)、QYC-2102C恒溫培養(yǎng)搖床(購自上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)、恒溫金屬浴(購自上海藍(lán)貌實驗儀器有限公司)。

1.4 引物設(shè)計合成參考GenBank數(shù)據(jù)庫中ILTVgD基因序列(登錄號：MK895002.1)，設(shè)計并合成1對特異性引物(見表1)，預(yù)擴(kuò)增長度1 134 bp，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。引物稀釋成濃度為10 pmoL/μL，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 引物序列信息

1.5 PCR擴(kuò)增與克隆測序取病死雞喉頭和氣管，加入適量PBS，研磨均勻，離心提取上清液，應(yīng)用DNA提取試劑盒提取總DNA，以其為模板對目的基因進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系25 μL：DNA模板 2 μL，2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物(10 pmol/μL)各1 μL，ddH2O 8.5 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，59 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸 10 min。 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，用凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄。將目的片段按膠回收試劑盒說明書方法進(jìn)行回收純化，純化后的PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體連接。連接體系10 μL：連接酶Solution I 5 μL，純化后的PCR產(chǎn)物4 μL，pMD18-T載體1 μL。連接條件：4 ℃過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。將轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞菌液加入LB液體培養(yǎng)基 1 mL中，37 ℃ 150 r/min活化1.5 h。取活化菌液200 μL均勻涂布于含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基，37 ℃選擇培養(yǎng) 18 h，取單個菌落進(jìn)行PCR檢測(方法同上)，相應(yīng)單菌落培養(yǎng)液提取重組質(zhì)粒，并進(jìn)行質(zhì)粒PCR鑒定和雙酶切鑒定。質(zhì)粒PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系及程序同上。雙酶切體系 30 μL：HindⅢ 1.5 μL，BamH Ⅰ 1.5 μL，10×Buffer 3 μL，重組質(zhì)粒cDNA 8 μL，ddH2O 16 μL。 雙酶切條件：37 ℃恒溫水浴過夜。經(jīng)質(zhì)粒PCR、雙酶切方法鑒定為陽性的重組質(zhì)粒送上海生物工程有限公司測序。

1.6 序列分析應(yīng)用MegAlign生物信息學(xué)軟件對測序結(jié)果進(jìn)行核苷酸序列同源性和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。

2 結(jié)果

2.1 目的基因PCR擴(kuò)增PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示，擴(kuò)增出1 134 bp目的基因條帶(見圖1)，與預(yù)期相符。

M：2 000 bp分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 1～4：4份組織樣品； 5：陰性對照圖1 目的基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 重組質(zhì)粒PCR鑒定PCR鑒定結(jié)果顯示，目的基因成功克隆至pMD18-T載體(見圖2)。

M：2 000 bp分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 1～2：重組質(zhì)粒； 3：陰性對照圖2 重組質(zhì)粒PCR鑒定結(jié)果

2.3 重組質(zhì)粒雙切酶鑒定雙酶切鑒定結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒酶切出現(xiàn)2 692 bp載體條帶和1 134 bp目的基因條帶，證明目的基因片段與載體pMD18-T連接成功，成功獲得陽性重組質(zhì)粒(見圖3)。

M：2 000 bp分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 1～2重組質(zhì)粒； 3：陰性對照圖3 重組質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果

2.4 目的基因序列分析

2.4.1gD基因基因序列同源性分析同源性分析結(jié)果顯示，ILTV 貴州株gD基因序列與國內(nèi)黑龍江、江蘇、上海和國外澳大利亞、突尼斯、美國、意大利的分離株gD基因的同源性均較高，在98.9%～99.1%之間，說明ILTV 貴州株gD基因遺傳較穩(wěn)定，變異程度低(見圖4)。

2.4.2 遺傳進(jìn)化樹分析遺傳進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示，ILTV貴州株與上海、黑龍江、江蘇、澳大利亞、突尼斯的分離株處于同一分支，親緣關(guān)系較近；而與美國分離株處于不同分支，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(見圖5)。

圖5 ILTV貴州株遺傳進(jìn)化樹分析

4 結(jié)論

本實驗基于ILTV的gD基因設(shè)計特異性引物，應(yīng)用PCR、基因克隆、測序分析等方法對gD基因進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：ILTV貴州株gD基因遺傳穩(wěn)定，進(jìn)化保守，未發(fā)生明顯變異，可為防控疫苗選擇提供依據(jù)。

5 討論

雞傳染性喉氣管炎是1種嚴(yán)重的急性呼吸道病毒傳染病，其發(fā)生和流行十分普遍，目前呈世界性分布，導(dǎo)致育成雞生長受阻及產(chǎn)蛋雞產(chǎn)蛋率下降，嚴(yán)重影響生產(chǎn)效益[4]。根據(jù)其臨床癥狀可分為喉氣管型和結(jié)膜型，傳播速度快，感染率高，但死亡率低[5]。由于該病與傳染性支氣管炎、新城疫、傳染性鼻炎等的癥狀極其相似，且都具有傳染性，因此可從病原核酸檢測和血清學(xué)抗體檢測進(jìn)行確診。ILTV通過侵入雞的喉頭、呼吸竇等組織進(jìn)行感染，潛伏期長，若不采取凈化措施會出現(xiàn)長期潛伏在雞體內(nèi)的情況，從而加大防控難度[6]。目前該病在臨床治療上還沒有特效藥，疫苗免疫接種是防控其發(fā)生和流行的最有效手段，用于該病的疫苗主要有弱毒疫苗和基因重組疫苗[7]。

本試驗通過對ILTV貴州株gD基因進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)該毒株gD基因較保守，遺傳穩(wěn)定性強(qiáng)，變異性低，現(xiàn)有的ILTV疫苗可以對該毒株進(jìn)行免疫防控。養(yǎng)殖場在做好日常防控管理工作的同時，應(yīng)選擇相應(yīng)疫苗進(jìn)行針對性免疫。