陳大芳， 李 平， 申金容， 唐明宗， 張云淞， 曾 金

(貴州省種畜禽種質(zhì)測定中心，貴州 貴陽 550018)

在我國的養(yǎng)牛業(yè)生產(chǎn)過程中，采用牛冷凍精液進(jìn)行人工授精技術(shù)已得到廣泛推廣和應(yīng)用，其中精液質(zhì)量的優(yōu)劣直接影響到遺傳改良效果。世界上畜牧業(yè)先進(jìn)發(fā)達(dá)的國家都已將種畜精液質(zhì)量安全列入監(jiān)管范圍[1]。近年來，我國為提高畜禽種業(yè)發(fā)展質(zhì)量，加強(qiáng)了對牛冷凍精液的常態(tài)化市場監(jiān)管，以便為養(yǎng)牛生產(chǎn)提供更多更好的凍精產(chǎn)品。其質(zhì)量監(jiān)控依據(jù)《牛冷凍精液》(GB 4143—2008)進(jìn)行檢測，檢測指標(biāo)有凍精外觀、劑型劑量、精子活力、前進(jìn)運(yùn)動精子數(shù)、精子畸形率、細(xì)菌數(shù)等[2]。本文主要針對牛冷凍精液的檢測項(xiàng)目內(nèi)容及相關(guān)質(zhì)量控制環(huán)節(jié)進(jìn)行介紹，供同行參考。

1 檢測條件要求

1.1 檢測室環(huán)境室內(nèi)保持清潔、整齊、安靜、無異味，配備控溫(空調(diào))、控濕(除濕機(jī))設(shè)備，保證工作時室溫在20～25 ℃，相對濕度在35%～55%，有溫濕度計監(jiān)控并進(jìn)行記錄。非相關(guān)人員不得進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室，工作時應(yīng)穿戴潔凈的工作服、手套、口罩、鞋、帽等，保持潔凈無菌的工作環(huán)境[3]。進(jìn)行細(xì)菌項(xiàng)目檢測的實(shí)驗(yàn)室要求安裝紫外線殺菌燈，工作進(jìn)行前與結(jié)束后均應(yīng)打開紫外線燈滅菌。

1.2 儀器設(shè)備按標(biāo)準(zhǔn)要求配置檢測儀器設(shè)備的數(shù)量、性能和精度，保持儀器完好率為100%。計量器具按照規(guī)定進(jìn)行檢定和校準(zhǔn)，儀器設(shè)備進(jìn)行正常維護(hù)，填好儀器的運(yùn)行日志和維護(hù)日志，注意精密儀器的防塵。玻璃器皿類用清水浸泡后在加有洗滌劑的溫?zé)崴兴⑾锤蓛簦僖来斡脻崈羲疀_洗、消毒、干澡后備用[3]。

1.3 試劑耗材化學(xué)試劑要使用分析純，嚴(yán)禁使用過期試劑。培養(yǎng)基及染色試劑可選擇商品化的半成品，無論是一次性或可重復(fù)使用的耗材都必須是無菌、無毒，如培養(yǎng)皿、載玻片等[3]。藥品柜要上鎖并張貼標(biāo)簽。試劑要分類存放，藥品容器的密封要求良好。危險化學(xué)藥品應(yīng)建立單獨(dú)保管室及專門的柜體保存。

2 抽樣要求

2.1 生產(chǎn)方抽樣生產(chǎn)方和使用方為質(zhì)量保證概率把關(guān)，按照《孤立批計數(shù)抽樣檢驗(yàn)程序及抽樣表》(GB/T 15239—1994)采用LQ=8.0模式A抽樣方案檢索1次抽樣方案，確定抽樣公牛樣本量。

2.2 質(zhì)量監(jiān)督抽樣質(zhì)量監(jiān)督抽樣檢驗(yàn)按照《產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督小總體計數(shù)一次抽樣檢驗(yàn)程序及抽樣表》(GB/T 15482—1995)采用D0=10，選用第2檢驗(yàn)等級的抽樣方案，確定抽檢公牛的樣本量。

3 檢測項(xiàng)目指標(biāo)

3.1 外觀肉眼觀察精液顏色、氣味是否異常(正常呈乳白色、略帶腥味)，有無任何雜質(zhì)，包裝是否完整規(guī)范，細(xì)管的管壁(或包裝袋)上是否標(biāo)識生產(chǎn)站名、公牛品種、公牛號、生產(chǎn)日期或批次，觀察細(xì)管外觀應(yīng)為“無裂痕，兩端封口嚴(yán)密”。

3.2 劑量取3支細(xì)管凍精于37 ℃水浴鍋中解凍2 min，擦去細(xì)管上的水分，剪去兩端，把精液分別倒入一小試管內(nèi)，用電動移液器準(zhǔn)確吸取精液，讀取讀數(shù)并記錄讀數(shù)結(jié)果。3支凍精的劑量平均數(shù)為該樣品劑量的檢測結(jié)果。計算公式如下：

Q：劑量值(mL)；n1：第1支樣品劑量(mL)；n2：第2支樣品劑量(mL)；n3：第3支樣品劑量(mL)

3.3 精子活力取3支細(xì)管凍精放置在37 ℃水浴鍋中解凍，將3支解凍的精液混合加入1.5 mL離心管中，取精液50 μL置于精液質(zhì)量分析系統(tǒng)顯微鏡專用載玻片上，顯微鏡載物臺溫度保持在38 ℃，用200～400倍顯微鏡觀察精子活力。每個樣片觀察3個視野，并觀察不同視野的精子運(yùn)動狀態(tài)，進(jìn)行精子活力判斷。計算公式如下：

M：活力；n1：第1視野活力；n2：第2視野活力；n3：第3視野活力

3.4 每劑量前進(jìn)運(yùn)動的精子數(shù)吸取解凍精液20 μL，注入盛有3.0%氯化鈉溶液0.98 mL的試管中，混勻，使之成為50倍稀釋精液。將備好的血球計數(shù)板用蓋玻片將計數(shù)室蓋好，用移液槍吸取稀釋精液打入蓋玻片邊緣，使精液自行流入到計數(shù)室中，均勻充滿，不能有氣泡或厚度過大，在400倍顯微鏡下觀察計數(shù)。(1)每劑量中精子數(shù)=5個中方格精子數(shù)×250萬(細(xì)管)×劑量值。(2)每劑量中呈前進(jìn)運(yùn)動精子數(shù)計算：C=s×m[C：每劑量中前進(jìn)運(yùn)動精子數(shù)(個)；s：每劑量中精子數(shù)(個)；m：活力(%)]。

3.5 精子畸形率

3.5.1 抹片用移液器吸取解凍精液1滴于載玻片一端，用另1張載玻片的一邊與樣品呈35°夾角，將精液樣品均勻涂抹于載玻片上，然后自然風(fēng)干約5 min，每個樣品制備2～3個抹片。

3.5.2 固定在風(fēng)干的抹片上滴中性福爾馬林固定液1.0～2.0 mL，固定15 min后用清水緩緩沖去固定液，然后自然風(fēng)干或吹干。

3.5.3 染色用移液管移取姬姆薩原液2 mL、磷酸緩沖液3 mL、蒸餾水5 mL于帶有平槽的有機(jī)玻璃槽中，將固定好的抹片反扣在有機(jī)玻璃面上，使姬姆薩染液滴于槽和抹片之間，讓其充滿平槽并使抹片接觸染液，染色1.5 h后用清水緩緩沖去染液，并自然風(fēng)干待用。

3.5.4 鏡檢制備好的抹片用顯微鏡(400～600倍)觀察，每個抹片觀察200個以上的精子(分左、右2個區(qū))，取2片的平均值，2片的變異系數(shù)不得大于20%。觀察時應(yīng)有序、系統(tǒng)地觀察每個視野內(nèi)的正常精子和畸形精子，邊觀察，邊用血球分類計數(shù)器進(jìn)行計數(shù)。精子的各種形態(tài)描述：(1)正常精子：頭頸部為橢圓形，中尾部自然延伸且均勻，頭頸、中段和尾部都正常時可計為正常精子。(2)畸形精子：頭部畸形有大頭、小頭、錐形頭、梨形頭、圓頭、無定形頭和雙頭等；頸部和中段畸形有頸部“彎曲”、中段非對稱地接在頭部、粗的或不規(guī)則的中段、異常細(xì)的中段或無線粒體鞘等；尾部畸形有短尾、多尾、發(fā)卡形尾、尾部斷裂、尾部彎曲(>90°角)和尾部寬度不規(guī)則等。

3.5.5 精子畸形率計算公式如下：

A：精子畸形率(%)；A1：畸形精子數(shù)(個)；S：精子總數(shù)(個)

3.6 細(xì)菌數(shù)(1)培養(yǎng)基的配制(營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和普通瓊脂培養(yǎng)基均可)，營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基質(zhì)量應(yīng)符合《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測定》(GB/T 7489.2—2003)要求。普通瓊脂培養(yǎng)基的制作：牛肉浸膏5 g，蛋白胨10 g，磷酸氫二鉀1 g，氯化鈉5 g，用蒸餾水1 000 mL溶解后加瓊脂粉20 g，加熱溶解。校正pH值為7.4～7.6，并用脫脂棉過濾，分裝于錐形瓶中高壓滅菌。(2)將滅菌培養(yǎng)基平皿編號，細(xì)管凍精37 ℃水浴解凍，用酒精棉球擦拭以保證無菌操作，將1支全部注入到平皿中，把已涼至50 ℃的普通瓊脂培養(yǎng)基(或營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基)以無菌操作倒入平皿內(nèi)，每皿約15 mL，并平放置平皿進(jìn)行搖動混勻，使精液和瓊脂充分混勻。同時做空白對照平皿。待瓊脂凝固后翻轉(zhuǎn)平皿，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h取出，計數(shù)平皿內(nèi)菌落數(shù)。每頭牛取2支做2個平皿，取平均值。計算公式如下：

B：細(xì)菌數(shù)(個)；n1：第1個平皿菌落數(shù)(個)；n2：第2個平皿菌落數(shù)(個)

4 檢測結(jié)果判定

4.1 檢驗(yàn)分類分常規(guī)檢驗(yàn)與型式檢驗(yàn)。(1)常規(guī)檢驗(yàn)是對凍精的單項(xiàng)目進(jìn)行檢驗(yàn)，是型式檢驗(yàn)的一部分，主要是在生產(chǎn)批入庫前和銷出時的檢驗(yàn)。(2)型式檢驗(yàn)是對凍精全部項(xiàng)目檢驗(yàn)，評定產(chǎn)品質(zhì)量是否全面符合標(biāo)準(zhǔn)，也是在生產(chǎn)方抽樣檢驗(yàn)、仲裁和質(zhì)量監(jiān)督抽樣檢驗(yàn)時選定項(xiàng)的檢驗(yàn)。

4.2 結(jié)果判定依據(jù)《牛冷凍精液》(GB 4143—2008)的規(guī)定要求進(jìn)行結(jié)果判定(見表1)。結(jié)果達(dá)到指標(biāo)要求判為“合格”，反之則為“不合格”。對“不合格”的精液產(chǎn)品要立即停止生產(chǎn)、經(jīng)營和使用。

表1 牛冷凍精液檢測項(xiàng)目指標(biāo)合格判定

4.3 判定示例進(jìn)行常規(guī)檢驗(yàn)或型式檢驗(yàn)時，樣品中全項(xiàng)指標(biāo)檢測達(dá)到要求才能判為“合格”，樣品中任何1項(xiàng)檢測未達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)要求的規(guī)定則判為“不合格”。結(jié)果判定示例見表2。

表2 牛冷凍精液產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢測示例

5 檢測質(zhì)量的控制

實(shí)行嚴(yán)格的管理制度，著力提升各個環(huán)節(jié)的檢測質(zhì)量，加強(qiáng)對管理體系文件的把控，定期開展內(nèi)審與管理評審，保持檢測過程的有效性與合理性，完善檢測體系質(zhì)量手冊、程序文件、作業(yè)指導(dǎo)書文件內(nèi)容，制訂有效的質(zhì)量控制方案，以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

5.1 人員考核在檢測分析過程中，人為因素是影響結(jié)果的主要因素，檢測人員的技術(shù)水平與操作技能會在很大程度上影響檢測結(jié)果[3]。對參與檢測的技術(shù)人員進(jìn)行嚴(yán)格培訓(xùn)，認(rèn)真學(xué)習(xí)檢測標(biāo)準(zhǔn)，理解標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容并按要求進(jìn)行檢測，確保能熟練掌握實(shí)驗(yàn)原理及檢測技術(shù)要點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)室要重視對新上崗人員的考核，組織人員檢測比對時要以本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)驗(yàn)豐富和能力穩(wěn)定的檢測人員結(jié)果作為參考值。如：精子畸形率的檢測技術(shù)難點(diǎn)主要在制片技術(shù)和讀片技術(shù)方面，對正常精子應(yīng)達(dá)成統(tǒng)一正確的認(rèn)識，能夠熟練鑒別正常精子形態(tài)與非正常精子形態(tài)并準(zhǔn)確計數(shù)，準(zhǔn)確計算畸形率。

5.2 能力驗(yàn)證能力驗(yàn)證通常有人員比對、儀器比對、實(shí)驗(yàn)室比對等方法。開展經(jīng)常性的檢驗(yàn)比對、統(tǒng)一檢測方法可顯著提高檢測水平，保證檢測結(jié)果的可信度。比對樣本要有代表性，提供同一樣本交各檢驗(yàn)員進(jìn)行精子檢測和分析，如果誤差在允許范圍內(nèi)則考核合格。也可以開展實(shí)驗(yàn)室之間的能力比對，定期將樣本送給具有相應(yīng)檢測能力的實(shí)驗(yàn)室檢測，將結(jié)果進(jìn)行比較、分析是否有差異等[1]。

6 小結(jié)

牛冷凍精液質(zhì)量檢測是牛人工授精工作的1項(xiàng)常規(guī)檢測技術(shù)，在養(yǎng)牛業(yè)生產(chǎn)過程中被廣泛應(yīng)用。掌握好牛冷凍精液的檢測技術(shù)，開展好常規(guī)檢驗(yàn)與型式檢驗(yàn)，可為種牛精液質(zhì)量安全常態(tài)化監(jiān)管提供技術(shù)支撐，生產(chǎn)單位才能為社會提供更多更好的種牛產(chǎn)品，為助推畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展打下堅實(shí)的基礎(chǔ)。