劉曉東， 彭利蘭， 莘海亮， 龍征榮

(黔東南民族職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴州 凱里 556000)

盲腸是大腸的起始部，下端為膨大的盲端，左側(cè)與回腸末端相連，上端連接升結(jié)腸，以回盲瓣與升結(jié)腸及回腸為界。盲腸壁結(jié)構(gòu)分為4層，由外向內(nèi)依次為：漿膜層、平滑肌層、黏膜下層和黏膜層。平滑肌層的外層為縱行肌纖維，內(nèi)層為環(huán)形肌纖維，二者都以螺旋式走行，以收縮和舒張來完成腸的機械性消化。黏膜層又分為3層：靠近黏膜下層的是1層平滑肌，稱為黏膜肌層；中間為結(jié)締組織，又稱為固有層；最后面向腸腔的是1層柱狀上皮細胞構(gòu)成的黏膜[1]。杯狀細胞是混在黏膜上皮中的黏液分泌細胞，底部狹窄，頂部膨大，充滿黏原顆粒，HE(蘇木精-伊紅)染色為藍色或空泡狀(多為空泡狀)。黏原顆粒主要是黏蛋白，黏蛋白分泌后與水結(jié)合形成黏液，有潤滑和飽和作用。本試驗通過對不同日齡小鼠盲腸黏膜厚度、肌層厚度和杯狀細胞分泌的黏蛋白測定及組織學(xué)觀察，探討小鼠盲腸的生長發(fā)育規(guī)律，從而為盲腸黏膜結(jié)構(gòu)及功能的研究提供基礎(chǔ)參考資料。

1 材料與方法

1.1 主要儀器萊卡石蠟切片機(RM2235)、光學(xué)顯微鏡(OLYMPUSCX23)、光學(xué)顯微照相儀(Nikon ECLIPSE 50i)、數(shù)顯恒溫箱(HH-6)、電子天平(AE323J)。

1.2 主要試劑酒精、甲苯、石蠟、蛋白膠、二甲苯、中性樹脂膠、10%福爾馬林、蘇木精、伊紅、中性福爾馬林固定液、1%阿利新蘭醋酸水溶液、過碘酸溶液、1 mol/L鹽酸、1%氨水、偏重亞硫酸鈉、無色品紅液(Schiff氏液)、Carnoy(卡諾氏)固定液。

1.3 試驗動物及飼料健康懷孕雌性昆明小白鼠24只，購自四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物生理實驗室。日糧配方含量和營養(yǎng)水平符合實驗小鼠的飼養(yǎng)標準(NRC 1994)，其中：玉米51.73%，魚粉3%，鈣1.3%，食鹽0.3%，棉粕3%，豆粕28%，磷酸氫鈣1.3%，總磷0.57%，油2.5%，預(yù)混料1%。

1.4 盲腸黏膜發(fā)育情況觀察分別隨機選取出生后第1、3、5、10、15、20、25、35、50日齡健康昆明小鼠各4只(雌、雄各半)，先禁食24 h，采用脊椎脫位法處死，剖腹取出盲腸，常規(guī)石蠟包埋，制作連續(xù)橫斷切片，通過DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(7.05版)軟件圖像分析系統(tǒng)觀察盲腸黏膜發(fā)育情況。

1.5 盲腸黏膜及肌層厚度檢測每只小鼠取新鮮盲腸組織3段(1.5 cm/段)，用10%中性福爾馬林固定24 h，隨機取盲腸1段修整后常規(guī)石蠟包埋，制作連續(xù)橫斷切片(4 μm)3片，HE染色，常規(guī)光學(xué)顯微鏡下(40×)觀察。每只小鼠取5張不連續(xù)的切片，每張切片隨機取5個視野，每個視野用以上圖像分析系統(tǒng)測定4個黏膜的長度和肌層的厚度，并觀察小腸黏膜形態(tài)發(fā)育中的組織學(xué)變化。

1.6 阿利新藍-PAS染色檢測黏蛋白取新鮮盲腸組織2段(1 cm/段)編號后，投入Carony固定液固定40 min，用無水酒精脫水，二甲苯透明、浸蠟、包埋。常規(guī)切片厚5 μm，脫蠟，浸入0.5%過碘酸氧化5 min，環(huán)境溫度20 ℃，用1%阿利新蘭醋酸水溶液染色30 min，流水沖洗5 min，再用蒸餾水浸洗2次，Schiff氏液(從冰箱取出升至室溫使用)避光染色15 min，0.5%偏重亞硫酸鈉浸洗2次，每次1 min，流水沖洗5 min，蒸餾水沖洗，蘇木精染色3 min，自來水沖洗，1%鹽酸酒精分化，再用自來水充分沖洗，1%氨水返藍，核染色稍淺為好，流水沖洗，常規(guī)脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固，顯微鏡(40×)觀察。每個視野用以上圖像分析軟件測定酸性和中性黏液的平均面積和光密度積分。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析黏膜厚、肌層厚、黏液面積和光密度積分數(shù)據(jù)用“平均數(shù)±標準差”表示，用SPSS 20.0軟件進行各組數(shù)據(jù)統(tǒng)計差異顯著性分析。

2 結(jié)果

2.1 盲腸黏膜發(fā)育組織學(xué)觀察組織學(xué)觀察結(jié)果顯示，小鼠黏膜層厚度隨日齡增加有增厚的趨勢，10日齡和15日齡黏膜厚度較5日齡有增加，35日齡黏膜厚度又較10日齡和15日齡有增加。見圖1～圖4。

圖1 5日齡小鼠盲腸壁HE染色

黏膜層未見明顯增厚，杯狀細胞稍有增多圖2 10日齡小鼠盲腸壁HE染色

黏膜層和肌層增厚，杯狀細胞明顯增多圖3 15日齡小鼠盲腸壁HE染色

黏膜層和肌層增厚，杯狀細胞進一步增多圖4 35日齡小鼠盲腸壁HE染色注：圖中Ⅰ為肌層，Ⅱ為黏膜層，箭頭指示為杯狀細胞

2.2 腸黏膜和肌層厚度測定小鼠盲腸黏膜厚度隨著日齡的增加呈鋸齒狀曲線增厚，1～20日齡均差異不顯著(P>0.05)，25日齡以后黏膜厚度比20日齡前顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)增加。肌層厚度隨著日齡的增加呈鋸齒狀曲線增厚，15日齡前均差異不顯著(P>0.05)，15日以后顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)增厚。見表1、圖5。

表1 1～50日齡小鼠盲腸黏膜和肌層厚度 μm

圖5 1～50日齡小鼠盲腸黏膜和肌層厚度變化曲線

2.3 盲腸黏膜的杯狀細胞分泌黏蛋白測定不同發(fā)育時期盲腸杯狀細胞分泌黏液數(shù)量不同。PAS染色可定性分析黏蛋白含量；測定黏液面積和光密度積分可定量分析黏蛋白含量，黏蛋白與前者呈正相關(guān)與后者呈負相關(guān)。通過對1、10、15、25、35日齡小鼠盲腸內(nèi)黏液面積和光密度積分測定，結(jié)果顯示隨著日齡的增加，黏液面積增加，光密度積分減少。15日齡以后與10日齡以前相比黏液面積差異極顯著(P<0.01)，10日齡之前均差異不顯著(P>0.05)；10日齡以后與1日齡相比光密度積分差異極顯著(P<0.01)。見表2、圖6～圖9。

表2 盲腸黏液面積和光密度積分

圖6 5日齡小鼠盲腸PAS染色

黏蛋白數(shù)量增多圖7 15日齡小鼠盲腸PAS染色

黏蛋白數(shù)量明顯增多，顏色深染圖8 25日齡小鼠盲腸PAS染色

黏蛋白數(shù)量和面積明顯增多，顏色深染圖9 35日齡小鼠盲腸PAS染色注：圖中箭頭所示為黏蛋白

3 結(jié)論

本試驗結(jié)果表明，隨著日齡的增長，小鼠盲腸的黏膜和肌層逐漸增厚，杯狀細胞也不斷增多，盲腸的排泄功能和腸黏膜屏障功能不斷增強。

4 討論

4.1大腸的黏膜層與小腸的根本區(qū)別是表面沒有絨毛，表面光滑亮潔呈紅白色。在顯微鏡下觀察，大腸黏膜層由單層柱狀上皮細胞和許多杯狀細胞構(gòu)成，杯狀細胞能分泌黏液保護腸壁潤滑糞便。肌層是大腸運動的主要動力來源。小鼠為雜食性動物，與豚鼠、家兔等草食性動物相比腸道較短，盲腸不發(fā)達，腸內(nèi)能合成維生素C。其盲腸壁的各層都明顯比其他部分的腸壁薄，淋巴組織也沒有腸的其他部分發(fā)達[2]。腸黏膜是吸收營養(yǎng)物質(zhì)的主要器官，營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收主要在動物腸道進行，腸道健康與否直接影響動物對營養(yǎng)物質(zhì)的攝取。特別是幼齡動物腸黏膜發(fā)育尚不完全，其生長、發(fā)育及健康狀況會影響動物的生長、抗病、免疫力等諸多方面[3]。本試驗結(jié)果顯示，小鼠盲腸黏膜和肌層厚度在總體趨勢上隨著日齡的增加呈現(xiàn)鋸齒狀曲線增加，這可能與腸黏膜處于發(fā)育狀態(tài)有關(guān)。

4.2杯狀細胞是黏膜層中的黏液分泌細胞，也廣泛見于動物的其他器官中，雖然是分散孤立的細胞，但具有顯著的分泌機能。其分泌的黏液或前驅(qū)物質(zhì)貯存于細胞中，有核的基底部較細而接近分泌物的貯留部從邊緣部分膨大，形狀猶如酒杯。脊椎動物腸黏膜中的杯狀細胞攝取葡萄糖和氨基酸，形成糖蛋白并貯存于杯狀部，隨后釋放入腸腔中形成黏液[4]。大腸內(nèi)的黏液主要呈酸性和中性，是推動大便的潤滑劑。據(jù)報道，腸上皮細胞與杯狀細胞分泌的黏液及絨毛內(nèi)淋巴細胞分泌的抗體共同組成一道免疫防護屏障，是黏膜免疫系統(tǒng)的一部分[5]。由此可見，免疫系統(tǒng)也伴隨小鼠的生長發(fā)育而逐漸完善。小鼠的盲腸黏液細胞基本上全部由杯狀細胞構(gòu)成，并且隨著日齡的增長，其數(shù)量也在不斷增加，盲腸的發(fā)育逐漸成熟，排泄功能逐漸完善。