楊敬端 何明 吳品

胃癌是我國常見腫瘤之一，近年來發(fā)病率日益增高。據(jù)統(tǒng)計，我國每年新發(fā)胃癌患者達40 萬人，死亡人數(shù)達30 萬人，嚴重威脅患者生命安危［1］。盡管近年來胃癌的診療取得了顯著進步，但在多數(shù)發(fā)展中國家胃癌的發(fā)病率及致死率仍在不斷升高［2］。故及時明確胃癌病情進展采取治療措施具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)29（Endoplasmic reticulum protein 29，ERp29）在新生蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的正確折疊及恢復中起著重要作用，與腫瘤發(fā)生密切相關［3］。而COP9 信號轉(zhuǎn)移體（COP9 signalosome complex，CSN）是一種多亞基蛋白復合體，通過調(diào)控泛素蛋白酶體的降解過程而參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，在CSN 亞單位中CSN5是CSN 第5 個亞單位，也是其活化中心，與多種腫瘤的進展密切相關［4］。此外，親環(huán)素J（Cyclophilins J，CyPJ）是一類低分子量多功能蛋白，可參與蛋白質(zhì)合成、修復、免疫抑制、誘導細胞調(diào)亡及調(diào)節(jié)細胞增殖等作用，是目前臨床研究惡性腫瘤的新靶點［5］。因此，本研究將分析胃癌患者CyPJ、ERp29 及CSN5 的表達及臨床意義?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取本院2015年6月至2017年6月收治的115 例胃癌患者作為研究對象。男性患者59 例，女性患者56 例，平均年齡（59.31±6.65）歲。收集腫瘤組織及腫瘤旁的正常胃粘膜組織，分別作為癌組織組。納入標準：①均經(jīng)病理檢查證實且符合日本胃癌學會第72 屆會議胃癌的標準治療指導方案［6］；②術(shù)前未接受化療、放療等輔助治療；③本研究患者臨床資料均完整；④無其它惡性疾病；⑤受試者簽署知情同意書。排除標準：①合并肝、腎、心臟臟器嚴重疾病者；②合并嚴重神經(jīng)功能、認知功能障礙者；③依從性差者。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準通過。

1.2 CyPJ、ERp29 及CSN5 水平檢測方法

1.2.1 儀器與試劑

SP 試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）、免疫組織化學二抗試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）、磷酸鹽緩沖液（PBS）（北京賽默飛世爾生物化學制品有限公司）、兔抗人CyPJ 抗體（英國Abcam 公司）、兔抗人ERp29 抗體（美國Abcam公司）、兔抗人CSN5 抗體（美國Santa Cruz 公司）。

1.2.2 檢測方法

采集所有研究對象胃癌組織及癌旁組織，使用生理鹽水清洗表面后保存在10%甲醛溶液中并置于-80℃恒溫箱，分為三份。

CyPJ、ERp29 及CSN5 水平的檢測采用免疫組織化學方法進行：鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)法（Streptomyces avidin peroxidase conjugation，SP）［7］，石蠟切片標本厚2 μm，烘烤60℃，二甲苯脫蠟，浸泡3 次。3 次離子水中浸泡抗原修復切片，磷酸鹽緩沖液（PBST）洗3 次。內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑滴加，室溫孵育15 min，沖洗。一抗滴加，室溫孵育1 h，沖洗。辣根酶標羊抗小鼠/兔IgG 聚合物滴加，室溫孵育30 min。對照組采用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）代替一抗；滴加山羊抗兔二抗（eBioscience）室溫孵育30 min。二氨基聯(lián)苯胺顯色，蘇木精復染，梯度酒精脫水，樹膠封片。

1.2.3 結(jié)果判斷

判斷CyPJ、ERp29 及CSN5 蛋白范圍的標準［8］：每張切片在鏡下分別以低倍鏡及高倍鏡進行觀察，對每張切片上中下及里外中9 個位置進行觀察，最后對2 位專家判斷結(jié)果進行比對（差異較大時，需重新同時共同讀片確定）。

采用Volm 雙評分法［8］進行判定，在染色均勻的腫瘤區(qū)，選取5 個高倍鏡視野（×400）：按陽性細胞百分率（A 值）評分［7］：＜25%為1 分，25%～50%為2 分，＞50%為3 分；按染色強度（B 值）評分：不著色為0 分，淺棕黃色為1 分，棕黃色為2 分，棕褐色為3 分。綜合染色陽性細胞數(shù)與染色強度判斷結(jié)果：陰性（-）：0 分，弱陽性（+）：1～2 分，中度陽性（++）：3～4 分，強陽性（+++）：5～6 分；兩種計分的乘積為每例的加權(quán)分數(shù)，加權(quán)分數(shù)為0 為陰性，其余均為陽性。

1.2.4 隨訪

所有患者治療結(jié)束后通過電話、微信、到院復診等方式進行隨訪3年，隨訪截止日期為2020年6月30日。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0 軟件分析，計數(shù)資料以n（%）表示，行χ2檢驗；計量資料采用（±s）描述，行t檢驗；予以Kaplan-Meier 生存分析CyPJ、ERp29 及CSN5 表達對胃癌患者預后生存的影響；采用Logistic 回歸分析影響胃癌患者預后生存的危險因素，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組CyPJ、ERp29 及CSN5 的表達情況比較

胃癌組織組CyPJ、CSN5 陽性表達率顯著高于癌旁正常組織組，ERp29 陽性表達率顯著低于癌旁正常組織組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1、圖1。

表1 兩組CyPJ、ERp29 及CSN5 的表達情況比較［n（%）］Table 1 Comparison of the expression of CYPJ，ERp29 and CSN5 between 2 groups［n（%）］

圖1 胃癌組織CyPJ、ERp29、CSN5 免疫組化染色圖（SP，×500）Figure 1 immunohistochemical staining of CYPJ，ERp29 and CSN5 in gastric cancer tissue（SP，×500）

2.2 CyPJ、ERp29 及CSN5 與胃癌患者不同病理參數(shù)的關系

年齡、性別、漿膜浸潤與胃癌患者CyPJ、ERp29及CSN5 表達無相關（P＞0.05）。臨床分期、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與患者CyPJ、CSN5 表達呈正相關，組織分化程度與CyPJ、CSN5 表達呈負相關（P＜0.05）。ERp29 與組織分化程度呈正相關，與臨床分期、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負相關（P＜0.05）。見表2。

2.3 115 例胃癌患者預后情況

截至隨訪結(jié)束，115 例胃癌患者生存79 例，死亡36 例，死亡率為31.30%。

CyPJ 表達陰性及表達陽性中位生存時間分別為（42.75±1.82）個月、（30.35±1.01）個月；ERp29 表達陰性及表達陽性中位生存時間分別為（30.79±1.08）個月、（39.76±2.15）個月；CSN5 表達陰性及表達陽性中位生存時間分別為（43.01±2.08）個月、（33.04±1.04）個月。生存分析顯示CyPJ 及CSN5（表達陰性）、ERp29（表達陽性）者生存期較長，Keplan-meier 生存曲線明顯不同（P＜0.05）。見圖2。

表2 CyPJ、ERp29、CSN5 與胃癌患者不同病理參數(shù)的關系［n（%）］Table 2 Relationship between CYPJ，ERp29 and different pathological parameters in patients with gastric cancer［n（%）］

圖2 CyPJ、ERp29、CSN5 蛋白生存曲線圖Figure 2 protein survival curve of CYPJ，ERp29 and CSN5

2.4 影響胃癌患者預后生存的單因素和多因素分析

組織中低分化、TNM 分期：Ⅲ+Ⅳ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、ERp29 陰性表達、CyPJ 及CSN5 陽性表達為影響胃癌患者預后生存的獨立危險因素（P＜0.05）。見表3。

表3 影響胃癌患者預后生存的單因素和多因素分析Table 3 univariate and multivariate analysis of prognostic factors in patients with gastric cancer

3 討論

近年來我國胃癌發(fā)病率逐年上升，盡管目前胃癌的外科手術(shù)已取得長足的進步，但術(shù)后復發(fā)轉(zhuǎn)移及死亡的風險仍較高［9］。本研究顯示，115 例胃癌患者死亡率為31.30%，基本與既往研究相似，故尋求有效治療靶點對降低胃癌患者死亡率有重要意義。

CyPJ 是親環(huán)素家族成員之一，一方面可協(xié)助合成蛋白質(zhì)，保護蛋白質(zhì)正確合成；另一方面具有核酸酶活性，參與細胞凋亡進程［10］。目前大量研究證實CyPJ 和乳腺癌、肝癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、甲狀腺癌等多種腫瘤發(fā)生密切相關［11］。ERp29 是新發(fā)現(xiàn)的分子量為29 KDa 的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)，其位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔，定位于12q24.13 基因，協(xié)助新合成蛋白質(zhì)分泌、轉(zhuǎn)運、折疊蛋白恢復正確空間構(gòu)象。相關研究表示，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)會因為體內(nèi)未折疊或錯誤折疊蛋白質(zhì)增多而發(fā)生未折疊蛋白質(zhì)反應，這時未折疊蛋白質(zhì)反應發(fā)出的信號調(diào)節(jié)會限制mRNA 的翻譯速度，使其表達水平下降，引發(fā)腫瘤［12］。Tang W 等學者［13］對乳腺癌研究發(fā)現(xiàn)，ERp29 通過對p38 的信號通路進行負調(diào)控，抑制乳腺癌細胞的生長和生存。CSN5 是一種金屬蛋白酶復合物，其參與多種細胞的凋亡及增殖。相關研究表示，腫瘤的進展與泛素蛋白酶體密切相關，而CSN5 參與泛素蛋白酶體降解、催化，故認為CSN5 腫瘤關系密切［14］。本研究結(jié)果說明CyPJ、CSN5、ERp29 在胃癌患者中惡變程度、侵襲轉(zhuǎn)移中占有重要作用。

同時，為明確影響胃癌患者預后影響的危險因素，本研究對胃癌患者進行為期3年隨訪發(fā)現(xiàn)，患者死亡率為31.30%。相關研究發(fā)現(xiàn)，CyPJ 與胃癌細胞增殖和凋亡、細胞周期調(diào)節(jié)、信號傳導有關蛋白相互作用，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程發(fā)揮作用，其水平與胃癌患者兩年生存率密切相關［14］。而相關國外研究也顯示，ERp29 表達水平可作為胃癌患者疾病程度與預后的生物學標志［15］。本研究予以Logistic回歸分析中顯示，組織中低分化、TNM 分期：Ⅲ+Ⅳ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、ERp29 陰性表達、CyPJ及CSN5 陽性表達為影響胃癌患者預后生存的獨立危險因素，與上述研究一致，有力證明了CyPJ、CSN5、ERp29 與胃癌患者關系密切，進一步提示CyPJ、CSN5、ERp29 通過參與腫瘤細胞的分化、浸潤和轉(zhuǎn)移影響胃癌患者臨床結(jié)局。但本研究由于納入的樣本量有限，研究結(jié)果有待于通過進一步擴大樣本量或多中心合作研究予以進一步證實。

綜上所述，CyPJ、ERp29 及CSN5 在胃癌組織中呈異常表達狀態(tài)，其表達水平與患者的腫瘤臨床病理特征及預后有關。