龍麗 田松婭 雷星 羅霞

重度聽力損失是最常見的先天性疾病之一，在出生時約有1/1 000 的新生兒出現(xiàn)［1］。2006年第二次全國殘疾人抽樣調查結果顯示：我國聽力殘疾者高達2 780 萬，占殘疾人總數(shù)的33%，其中7 歲以下的聽力殘疾兒童高達80 萬人，并以每年3.5 萬聾兒的速度增長，很大部分為先天性耳聾［2］。這些患兒的出生給家庭及社會造成很大的不幸和沉重的負擔。統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示：約60%的耳聾屬于遺傳性耳聾。正常群體中攜帶耳聾基因的比例高達5%～6%［3］，因此耳聾發(fā)病率一直居高不下。如何預知這些先天性耳聾患兒的出生，是在產(chǎn)前檢查過程中需要解決的問題。遺傳性耳聾基因GJB2、SLC26A4及線粒體基因（mtDNA12SrRNA）和GJB3 的突變是導致大部分遺傳性耳聾發(fā)生的主要突變基因。本次研究主要探討銅仁市各族育齡婦女中4 個常見遺傳性耳聾基因的分布情況。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2019年8月至2020年10月在本院進行產(chǎn)前檢查的各族育齡婦女1 723 例為研究對象，年齡17～47 歲，平均年齡（28.30±2.15）歲。其中漢族628 例，400 例苗族，469 例土家族及226 例侗族孕婦。所有研究對象均知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 血液標本采集

按照采血標準操作流程采取受檢者外周血3～5 mL，加入乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）抗凝的采血管，4℃冰箱保存血樣。

1.2.2 血液基因組DNA 提取

DNA 提取試劑盒使用廣東凱普科技生物有限公司提供的離心柱提取試劑盒。具體步驟按照說明書進行。

1.2.3 PCR 擴增

擴增試劑由廣東凱普科技生物有限公司提供的擴增試劑盒，擴增程序為95℃15 min，97℃50 s、60℃60 s、72℃120 s 共35 個循環(huán)，72℃10 min。

1.2.4 擴增產(chǎn)物雜交

PCR 產(chǎn)物95℃變性10 min，立即浸入冰水混合物中冰浴3 min。按要求放好配件，鋪好雜交膜條，預雜交45℃2 min 以上；開泵，排雜交液；雜交清洗3～4 次；加入封阻液，封阻；加酶標液0.5 mL；溶液A 清洗四次；加顯色液0.5 mL，顯色6 min；加雜交液0.8 mL，清洗3 次；加蒸餾水清洗晾干。

1.2.5 結果判讀

①空白對照：不出現(xiàn)藍紫色斑點。②正常樣本：在生物素點及所有正常探針處出現(xiàn)藍紫色斑點。③陽性樣本：正常探針及對應的突變探針位點都出現(xiàn)藍紫色斑點，為該位點的雜合突變或雜合缺失；突變探針位點出現(xiàn)藍紫色斑點，而對應的正常探針位點沒有出現(xiàn)藍紫色斑點，為該位點的純合突變或純合缺失。④其它：若某個檢測位點的正常探針和突變探針都未出現(xiàn)藍紫色斑點，可能是該檢測位點出現(xiàn)新的突變類型，建議做進一步的分析，如測序等。

1.3 統(tǒng)計學方法

使用SPSS 26.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計數(shù)資料用n（%）的形式表示，用卡方檢驗或Fisher檢驗方法。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 1 723 例育齡婦女中檢測出常見耳聾基因突變位點結果分析

本次研究共檢出耳聾基因攜帶者3.6%（62/1723）。見表1、圖1、圖2。

表1 1 723 例孕婦耳聾基因突變位點分布情況Table 1 Distribution of deafness gene mutation sites in 1 723 pregnant women

2.2 不同民族之間的攜帶率比較分析

不同民族之間的攜帶率比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2、圖3。

圖1 常見耳聾基因突變位點Figure 1 Common deafness gene mutation sites

圖2 耳聾少見基因突變位點測序結果Figure 2 Sequencing results of rare deafness gene mutation sites

表2 不同民族之間的攜帶率比較結果［n（%）］Table 2 Comparison results of carrying rate among different nationalities［n（%）］

圖3 不同民族之間的攜帶率比較柱狀圖Figure 3 Bar chart of comparison of carrying rate among different nationalities

2.3 不同民族之間的突變類型比較分析

不同民族之間的主要耳聾基因突變類型比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 不同民族之間的常見突變類型比較［n（%）］Table 3 Comparison of common mutation types among different nationalities［n（%）］

3 討論

耳聾依據(jù)是否伴有耳外組織的異?；虿∽兛蓪⑵浞譃榫C合征性耳聾（SHL）和非綜合征性耳聾（NSHL）［4］。本次研究中耳聾基因的突變頻率為3.6%，略低于張昊晴等的報道［5］。GJB2 基因編碼的Cx26 屬于縫隙連接蛋白基因家族，與相鄰細胞的縫連接蛋白組成一個完整的縫隙連接通道，這些通道在信息傳導和物質交換中起重要作用［6］。GJB2 基因突變方式復雜多變，目前已有140 多種突變方式被報道［7］，其中顯性突變9 種，235delC是最常見的致病性突變［8］，純合突變導致常染色體隱性遺傳性耳聾，患者多為雙耳重度耳聾，不僅純合突變可以致聾，235delC 和其他致病突變位于兩條不同的染色體上形成雙重雜合性突變時，也可以導致耳聾。本研究結果符合此前235delC為國內最常見基因突變的結論［9］。

SLC26A4基因位于人類染色體7q31，含21 個外顯子，編碼含有780 個氨基酸的蛋白質Pendrin［10］。Pendrin 作為離子轉運體，調節(jié)內淋巴液的離子平衡。SLC26A4基因IVS7-2A＞G 突變是中國大前庭導水管患者群的熱點突變位點，15.23%的耳聾患者攜帶此突變，74.8%的大前庭導水管患者攜帶此突變［11］。本次研究中SLC26A4 的攜帶率為0.99%，其中IVS7-2A＞G 攜帶率為0.81%，是SLC26A4 基因突變位點中最常見的類型。SLC26A4 基因突變耳聾患兒出生時聽力篩查一般表現(xiàn)為正常，易被忽視，攜帶者篩查是避免SLC26A4 基因突變所致后天性遺傳性耳聾出生缺陷發(fā)生的重要手段。

線粒體12SrRNA A1555G 突變、C1494T 突變等與氨基糖甙類藥物導致的耳聾的發(fā)病密切相關［12］。有此突變患者的線粒體12S 核糖體的空間結構與氨基糖苷類藥物作用的靶點更加相似，一旦接觸氨基糖苷類藥物就很容易與之結合，導致線粒體組織的破壞，最終引起藥物性聽力障礙的發(fā)生［13］。本次研究中檢測出突變位點為m.1494C＞T和m.1555A＞G，主要突變位點為m.1555A＞G，共檢出6 例mtDNA 耳聾基因攜帶者，mtDNA 耳聾基因攜帶率為0.35%，低于此前儲穆庭所作研究［14］。本研究結果提示在育齡婦女中進行線粒體12SrRNA基因篩查，及時發(fā)現(xiàn)線粒體突變攜帶者，并對攜帶者及其所有母系家屬進行宣教禁止使用氨基糖苷類藥物，可以有效避免藥物性耳聾的發(fā)生。

GJB3 基因是1998年我國科學家夏家輝院士研究報道的第一個“本土基因”［15］，該基因538C＞T 位點的突變被認為與顯性遺傳高頻聽力下降有關。GJB3 基因與GJB2 基因雖然不在同一條染色體上，但都編碼連接蛋白，在內耳離子平衡中發(fā)揮作用，按照雙等位基因致聾的模式，有可能GJB2 基因與GJB3 基因共同導致耳聾患者的發(fā)病。如果GJB3基因c.538C＞T 雜合突變攜帶者與GJB2 基因雜合突變者婚配就可能導致下一代耳聾遺傳病的發(fā)生。因此GJB3 的突變頻率在育齡婦女篩查中雖然不高，但其篩查也不能忽略。

此次在漢族，侗族，土家族，苗族育齡婦女中所做的研究與此前李琦，郭斌等［16-17］所做研究結果有差別，這可能是由于本次研究所檢測樣本數(shù)量太少，抽樣誤差所致；也可能是不同地域和民族之間本身存在有差異。

我國是一個多民族大家庭，幅員廣闊，各地區(qū)人群的遺傳特點有很大的差異。因此，在不同地區(qū)和不同民族中，應結合當?shù)囟@基因的表現(xiàn)特征，制定出適合本地區(qū)的篩查策略及預防措施。同時由于基因檢測技術的快速發(fā)展也積極推動了遺傳性耳聾診斷的發(fā)展。在分子診斷技術的基礎上結合地方實際情況建立適宜的遺傳性耳聾基因篩查模式，才能實現(xiàn)降低遺傳性耳聾出生缺陷的目標。