帥敏 薛薇 黃超 鄒晨 田智

血液核酸擴(kuò)增技術(shù)是一種高靈敏度的血液傳染病檢測技術(shù)，能顯著縮短病毒感染檢測“窗口期”，檢出病毒變異及免疫靜默的感染者，降低輸血傳播病毒的風(fēng)險［1］。自從血站實施核酸檢測全覆蓋以來，不同試管類型、離心溫度和離心時間對核酸檢測結(jié)果的影響，尤其是對HIV 核酸檢測結(jié)果的影響尚不清楚。對HIV 強陽性樣本而言，無論如何處理核酸都能檢測出來，討論意義不大。只有對HIV 窗口期樣本的核酸檢測結(jié)果進(jìn)行分析才能看出試管類型、離心溫度和離心時間對HIV 窗口期樣本核酸檢測結(jié)果的影響［2］。目前這方面一直缺少相關(guān)實驗數(shù)據(jù)的說明，這主要是由于HIV 窗口期樣本很難遇到。2018年8月初，檢驗科檢測出一例HIV 窗口期樣本（對拆分出的HIV 反應(yīng)性樣本都按窗口期樣本來對待，后期結(jié)果證明該樣本為HIV 窗口期樣本），及時對同時留取的用三種類型真空采血管樣本進(jìn)行核酸檢測，取得了相關(guān)檢測數(shù)據(jù)，并及時完成對該樣本的病毒載量檢測。市疾控中心追蹤三個月后再次采血進(jìn)行WB 確認(rèn)實驗，確認(rèn)結(jié)果為HIV 陽性［3］?，F(xiàn)將對該HIV 窗口期樣本的確認(rèn)過程和三種不同處理模式的核酸檢測結(jié)果進(jìn)行回顧性分析，以探討不同試管類型、離心溫度和離心時間對HIV 窗口期樣本核酸檢測結(jié)果的影響。

1 材料與方法

1.1 樣本來源與處理

1.1.1 樣本來源

2018年7月30日按操作規(guī)程采集的無償獻(xiàn)血者樣本，留取三管樣本，第一管為帶分離膠促凝的酶免檢測樣本，第二管為帶分離膠EDTA-K2抗凝的核酸檢測樣本，第三管為EDTA-K2抗凝的血型檢測樣本（無分離膠），每管都留取5 mL 全血樣本［4］。

1.1.2 樣本處理

采樣后對三份樣本進(jìn)行離心。帶分離膠促凝樣本，離心參數(shù)25℃，1 600 r/min，10 min；帶分離膠EDTA-K2抗凝的核酸檢測樣本，離心參數(shù)5℃，1 600 r/min，20 min；EDTA-K2抗凝樣本（無分離膠），離心參數(shù)25℃，1 600 r/min，5 min［5］。

1.2 儀器與試劑

KUBOT8420 常溫離心機（日本，久保田商事株式會社）、ML-STAR8CH 全自動加樣儀（瑞士，漢密爾頓）、FAME24/20 全自動酶聯(lián)免疫分析儀（瑞士，漢密爾頓）；DA3000、DA3500 核酸提取儀（中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司）、smart32 核酸提取儀（中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司）；AFD9600 PCR 擴(kuò)增儀（杭州，安杰思）、ABI7500 PCR 擴(kuò)增儀（美國，ABI 公司）［6］。

常規(guī)血清學(xué)檢測試劑：索靈HBsAg（批號D557910 效期20190205）；新創(chuàng)HBsAg（批號2018045110 效期20190426）；Ortho 抗-HCV（批號EXE285 效期20181221）；科華抗- HCV（批號201801021 效期20190115）；萬泰抗-TP（批號N20180206 效期20190131）；新創(chuàng)抗-TP（批號2018017501 效期20190102）；萬泰HIV 檢測試劑，（批號I 20180205 效期20190131）；伯樂HIV 檢測試劑，（批號7J0409 效期20181121）；科華ALT 速率法試劑，（批號20180112，效期20190107）；核酸檢測試劑：中山大學(xué)達(dá)安股份有限公司，批號2017003效期，20181120；病毒載量檢測試劑：中山大學(xué)達(dá)安股份有限公司，批號2018004，效期20190514 蛋白印跡檢測試劑：MP Diagnostics HIV BlOT 2.2 人類免疫缺陷病毒（HIV1+2 型）抗體檢測試劑盒（免疫印跡法），批號AE8007，效期20191101；檢測膜批號AB8C03049A，效期20200301。

1.3 方法

對該獻(xiàn)血者樣本進(jìn)行血清學(xué)檢測、8 混樣核酸檢測，單樣本拆分檢測［7］。確認(rèn)該樣本核酸檢測結(jié)果為HIV 陽性后，對同時留取的3 種類型樣本進(jìn)行核酸單樣本檢測和HIV 病毒載量檢測。三個月后由CDC 工作人員找到該獻(xiàn)血者重新采集樣本進(jìn)行WB 確認(rèn)實驗［8］。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS Statistics17.0 進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析；對離心溫度、離心時間與核酸檢測結(jié)果進(jìn)行雙變量相關(guān)分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清學(xué)檢測結(jié)果

該樣本HBsAg、Anti-HCV、HIV-Ag/Ab、Anti-TP血清學(xué)檢測結(jié)果均為陰性，ALT 結(jié)果正常。見表1。

表1 HIV 窗口期樣本血清學(xué)檢測結(jié)果Table 1 serological test results of HIV window period samples

2.2 核酸檢測結(jié)果

確定該樣本核酸檢測拆分結(jié)果為反應(yīng)性結(jié)果后，第一時間馬上對三種類型試管的樣本進(jìn)行核酸檢測。見表2。

表2 HIV 窗口期樣本三種試管的核酸檢測結(jié)果Table 2 nucleic acid test results of three types test tubes of HIV window period samples

2.3 蛋白質(zhì)免疫印跡（WB）確認(rèn)結(jié)果

病毒載量檢測結(jié)果HIV 陽性擴(kuò)增，濃度為3.28×103IU/mL。市CDC 三個月后找到該獻(xiàn)血者再次采樣進(jìn)行WB 確認(rèn)實驗，WB 確認(rèn)結(jié)果為HIV-1 抗體陽性，檢出條帶有P24、gp41、P51、P66、gp120、gp160。見圖1。

圖1 WB 確認(rèn)結(jié)果電泳圖Figure 1 Electrophoretogram of WB confirmation results

離心5、10 和20 min 的核酸檢測結(jié)果比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。離心溫度5℃和25℃的核酸檢測結(jié)果比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。Ct 值的均值x=32.62，標(biāo)準(zhǔn)差S=0.14，變異系數(shù)CV=0.44%，極差為0.36Ct 值。見表3。

表3 HIV 窗口期樣本三種類型試管不同處理條件核酸檢測結(jié)果對比Table 3 Comparison of nucleic acid detection results of three types of test tubes with different treatment conditions in HIV window period samples

3 討論

通過對帶分離膠抗凝、促凝和不帶分離膠抗凝真空采血管HIV 窗口期樣本核酸檢測結(jié)果的分析，了解三種類型真空采血管不同離心時間、不同離心溫度對窗口期HIV 樣本核酸檢測結(jié)果的影響。北京市血液中心的研究也表明“在不超過30℃的采血環(huán)境中，NAT 標(biāo)本的現(xiàn)場保存，只需要和采集的血液一樣保存即可，并在24 小時內(nèi)離心處理，如此操作不會對HBV、HCB、HIV-1 弱陽性標(biāo)本d2 的檢測質(zhì)量產(chǎn)生影響”［2］。雖然北京血液中心的研究是在不同廠家生產(chǎn)的帶分離膠抗凝真空采血核酸檢測結(jié)果之間進(jìn)行，而本次的研究是在不同類型真空采血管核酸檢測結(jié)果之間進(jìn)行，但研究結(jié)果都表明用合適的條件處理核酸檢測樣本不會影響核酸檢測的質(zhì)量。

三種類型試管樣本核酸檢測Ct 值的極差是0.36，足量、無溶血、無脂血的三種類型試管的樣本都可以用于核酸檢測。HIV RNA 的濃度在血漿和血清中差別很小；有無分離膠對HIV 窗口期樣本核酸檢測結(jié)果影響很小，分離膠的主要作用是防止細(xì)胞破裂和溶血后對核酸檢測的影響。足量無溶血的三種類型試管的樣本都可以用于核酸檢測，能夠解決核酸檢測5 mL 試管樣本量在遇到拆分無效時面臨的樣本量不足的問題。混樣檢測需要的樣本量在150～300 μL 之間，拆分樣本量在960～1 600 μL 之間，正常的混樣和拆分樣本量僅需5 mL，個別拆分無效的樣本可以用5 mL 帶分離膠的促凝試管樣本進(jìn)行拆分。這樣就不僅減少獻(xiàn)血者血液的采集量，還減少8 mL 真空采血管成本的支出，也有利于實驗室樣本管理體系的標(biāo)準(zhǔn)化。以京津冀地區(qū)2018年14 個采供血機構(gòu)檢測數(shù)據(jù)顯示，核酸混樣檢測有效批中pool 的無效率為0.2%（244/123697pool）［4］，按6 樣本混樣計算約74 萬份樣本中只有1 464 份樣本需要重新檢測，而這其中只有拆分無效的樣本才需要用到第二份5 mL 試管的樣本。采用三種類型試管互備核酸檢測和酶免檢測的模式，可以節(jié)約大量采購8 mL 真空采血管的成本。

由于HIV 窗口期樣本很難遇到，所以數(shù)據(jù)量較小，以上分析只是該例HIV 窗口期樣本的分析結(jié)果。