許育雙 劉思平 宋蘭林 吳瑞楓 裘毓雯 賈蓓★

22q11.2 微缺失綜合征（22q11.2 deletion syndrome，22q11.2DS）是22q11.21-22q11.23區(qū)域缺失引起的一類臨床癥候群，在新生活產(chǎn)嬰兒中患病率約為1∶4 000，男女患病率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，是人類最常見(jiàn)的微缺失綜合征［1］。22q11.2 微缺失綜合征最常見(jiàn)的臨床癥狀被概述為CATCH22（Cardiac defects，Abnormal facial features，Thymic hypoplasia，Cleft palate，and Hypocalcemia ，Chromosome 22）［2］，其表型極具多樣性，輕癥者可表現(xiàn)正常，重癥者則可以出現(xiàn)累及全身各個(gè)組織和器官的癥狀，表現(xiàn)為嚴(yán)重的機(jī)能障礙。其中最主要的表征為合并先天性心臟病，約占70%～80%，而合并的先天性心臟病中動(dòng)脈圓錐發(fā)育異常最為常見(jiàn)，如法洛氏四聯(lián)癥（17%～22%）、主動(dòng)脈弓離斷（14%～15%）、室間隔缺損（13%～14%）等［3］。此外，在先天性心臟病的前瞻性研究中發(fā)現(xiàn)，室間隔缺損、主動(dòng)脈弓離斷、法洛氏四聯(lián)癥中存在22q11DS 的比例分別為22.73%、9.09%、18.8%［4］。本研究將對(duì)產(chǎn)前超聲發(fā)現(xiàn)先天性心臟病的胎兒進(jìn)行22q11.2 微缺失的遺傳學(xué)產(chǎn)前診斷，并對(duì)其表型與基因型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，以期為遺傳咨詢、妊娠指導(dǎo)、出生后臨床干預(yù)提供重要依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

2014年1月至2019年10月在本院婦產(chǎn)科經(jīng)胎兒超聲檢查診斷為先天性心臟畸形的胎兒228例。其中單純性心臟病162 例，心臟復(fù)雜畸形66例；平均孕周為（23±4.80）周；平均（29.48±5.50）歲。

1.2 方法

對(duì)獲得的胎兒細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)行染色體核型分析，選擇染色體核型正常的樣本行全基因組單核苷酸多態(tài)性微陣列芯片（single nuclectide polymorphisme array，SNP-array）分析，對(duì)確診為染色體22q11.2 微缺失的胎兒樣本，進(jìn)一步用熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）和多重連接依賴探針擴(kuò)增（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）技術(shù)對(duì)胎兒及其父母進(jìn)行22q11.2 微缺失驗(yàn)證。本研究已獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)同意，所有入選孕婦及其家屬簽署了知情同意書。

1.2.1 染色體核型分析和基因組DNA 的提取

實(shí)施絨毛取樣、羊膜腔穿刺術(shù)或臍帶血穿刺術(shù)，采集胎兒的絨毛、羊水或臍血，同時(shí)采集胎兒父母外周靜脈血。對(duì)胎兒樣本常規(guī)行細(xì)胞培養(yǎng)，后行G 顯帶、核型分析。同時(shí)按照試劑盒操作說(shuō)明，使用基因組DNA 提取試劑盒（北京天根生化科技公司）提取樣本基因組DNA。

1.2.2 SNP-array 分析

對(duì)核型未見(jiàn)異常的DNA 標(biāo)本，采用全基因組SNP 微陣列芯片技術(shù)（lumina HumanCytoSNp12 Beadchip/Iumina?OmniZhongHua- 8v1.3 Beadchip，美國(guó)），按照操作程序進(jìn)行DNA 提取、gDNA 變性、全基因組擴(kuò)增過(guò)夜、DNA 片段化、DNA 片段醇沉淀重懸、芯片雜交過(guò)夜、單堿基延伸、芯片掃描、結(jié)果判讀。以專用分子核型軟件（Karyostudio Software）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行拷貝數(shù)變異及基因分型分析，按照說(shuō)明書，以≥50 個(gè)探針標(biāo)記和≥100 Kb 分辨率檢測(cè)人類基因組拷貝數(shù)變異及雜合性缺失。

1.2.3 FISH 檢測(cè)

對(duì)結(jié)果為22q11.2 微缺失的樣本行FISH 進(jìn)行驗(yàn)證，采用雙色熒光探針試劑盒（DiGeorge/VCSF Region Probe，Vysis，美國(guó)），其內(nèi)含有TUPLE1 探針（22q11.2 區(qū)域，紅色）和對(duì)照探針ARSA（22q13.3 區(qū)域，綠色）進(jìn)行檢測(cè)。按照FISH 操作程序進(jìn)行制片、干燥、變性、雜交、洗滌、染色和鏡檢，拍取熒光信號(hào)。

1.2.4 MLPA 檢測(cè)

采用荷蘭MRC-Holland 公司的22q11.2 微缺失檢測(cè)試劑盒（SALSA MLPA P250 Kit）進(jìn)行驗(yàn)證。按照試劑說(shuō)明對(duì)提取的全基因組DNA 進(jìn)行變性、雜交、連接、PCR 擴(kuò)增，使用AppliedBiosystems 3500型測(cè)序儀（ABI，美國(guó)）對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，應(yīng)用MRC-Holland 公司提供的Coffalyser.Net 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)算該區(qū)域各基因位點(diǎn)的拷貝數(shù)。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以n（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胎兒染色體核型分析結(jié)果

228 例樣本中染色體非整倍體64 例，其中21三體25 例、18 三體30 例、13 三體4 例、45，X 2 例、48，XXY，+18 1 例、染色體三倍體2 例，64 例染色體數(shù)目異常胎兒大部分病例合并心外多發(fā)畸形。

2.2 胎兒全基因組SNP 微陣列芯片檢測(cè)結(jié)果

在染色體非整倍體未見(jiàn)異常的164 例樣本中，發(fā)現(xiàn)9 例22q11.2 微缺失（圖1），檢出率為5.49%（9/164）。其中，法洛氏四聯(lián)癥胎兒16 例，檢出3 例，占比為18.75%（3/16），在先天性心臟病確診中占比最高（表1）；非法洛氏四聯(lián)癥先心病胎兒148例，檢出6 例，占4.05%（6/148）。法洛氏四聯(lián)癥胎兒確診率（18.75%）高于非法洛氏四聯(lián)癥先心病胎兒確診率（4.05%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。確診22q11.2 的9 例胎兒中，7 例為L(zhǎng)CR A 與LCR D 之間的經(jīng)典缺失，1 例為包含TBX1 基因的非經(jīng)典缺失，1例為不包含TBX1 基因的非經(jīng)典缺失（圖2）；行父母全基因組SNP 微陣列檢測(cè)的2 對(duì)，結(jié)果均未見(jiàn)異常，另7 例父母未做相關(guān)基因檢測(cè)。

圖1 病例2診斷為22q11.2微缺失綜合征的SNP-array結(jié)果Figure 1 SNP-array analysis results analysis diagram of case 2 diagnosed with 22q11.2 microdeletion syndrom

表1 228 例先心病胎兒染色體及22q11.2 微缺失檢測(cè)結(jié)果［n（%）］Table 1 Chromosome deletion and 22q11.2 deletion syndrome were detected in 228 cases of congenital heart disease［n（%）］

圖2 9 例22q11.2 缺失區(qū)域的分布圖Figure 2 22q11.2 deletion region distribution in 9 case

2.3 胎兒FISH 和MLPA 驗(yàn)證結(jié)果

9 例22q11.2 微缺失胎兒間期細(xì)胞，僅一條22號(hào)染色體見(jiàn)一紅色熒光雜交信號(hào)（TUPLE 探針）和一綠色熒光雜交信號(hào)（ARSA 探針），另一條染色體僅見(jiàn)一綠色熒光雜交信號(hào)，表明22q11.2 存在缺失。見(jiàn)圖3～4。

圖3 病例2 診斷為22q11.2 微缺失綜合征的FISH 圖像（×1000）Figure 3 FISH image of of case 2 diagnosed with 22q11.2 microdeletion syndrome（×1000）

圖4 mlpa 電泳結(jié)果圖Figure 4 Figure of MLPA electrophoresis results

2.4 妊娠結(jié)局

9 例22q11 微缺失胎兒和167 例染色體異常胎兒均終止妊娠。繼續(xù)妊娠的有：15 例室間隔缺損、1 例法洛氏四聯(lián)癥、23 例血管走形異常、8 例心臟復(fù)雜畸形、5 例其他心臟病，均分娩后心胸科隨診，部分患兒適時(shí)手術(shù)，術(shù)后恢復(fù)良好。

3 討論

在相關(guān)報(bào)道中，約75%～85%的染色體22q11.2微缺失綜合征表現(xiàn)為伴有先天性心臟病［5］，先天性心臟病胎兒染色體22q11.2 微缺失綜合征的發(fā)生率為1.56%［6］。本研究結(jié)果高于既往報(bào)道，可能與孕婦行胎兒超聲檢查的孕周有關(guān)。這也說(shuō)明染色體22q11.2微缺失綜合征是導(dǎo)致胎兒先天性心臟病的重要因素。染色體22q11.2 微缺失綜合征是22 號(hào)染色體上22q11.21～22q11.23 區(qū)域缺失導(dǎo)致，該區(qū)域的缺失是低拷貝重復(fù)序列（low copy repeats，LCR）非同源重組導(dǎo)致的［7］。在基因型與表型關(guān)聯(lián)研究中，最受關(guān)注的是缺失導(dǎo)致TBX1 基因單倍劑量不足，影響了胚胎期心臟神經(jīng)嵴細(xì)胞功能的正常表達(dá)，導(dǎo)致心臟發(fā)育異常［8-9］。另外，該區(qū)域內(nèi)Hira 基因突變將影響心臟的環(huán)化以及神經(jīng)崎細(xì)胞的正確遷移，進(jìn)而導(dǎo)致先天性心臟?。?0］。

在本研究中，病例8 的缺失區(qū)域不包含TBX1和Hira 基因但同樣表現(xiàn)為復(fù)雜的心臟發(fā)育異常。檢索DECIPHER 數(shù)據(jù)庫(kù)的病例發(fā)現(xiàn)，與本案例基因拷貝數(shù)變異（Copy number variations，CNV）大小有60%以上交疊的有8 個(gè)病例（ID：254238，2366，401245，249397，251228，262483，276696，292353）。Lopez-Rivera 等［11］分析了攜帶22q11.2 缺失的14 例患者，其中有12 例合并有腎臟發(fā)育異常（腎發(fā)育不全或發(fā)育不良），2 例合并其它泌尿系統(tǒng)異常；泌尿系統(tǒng)異常合并心臟發(fā)育異常的僅有1 例。通過(guò)病例對(duì)照研究斑馬魚和小鼠模型，Lopez 推測(cè)CRKL基因的單倍型不足是22q11.2 微缺失患者腎臟發(fā)育異常的遺傳驅(qū)動(dòng)因素。然而在本研究的9 例攜帶22q11.2 缺失的胎兒中，只有1 例胎兒觀察到腎臟的超聲軟指標(biāo)異常，提示CRKL 基因劑量不足導(dǎo)致的腎臟異常胎兒期表現(xiàn)可能不明顯，導(dǎo)致心臟發(fā)育異常的證據(jù)尚不充分。22q11.2LCR C～D 缺失導(dǎo)致心臟發(fā)育異?？赡苁青徑蛐?yīng)，或區(qū)域內(nèi)存在調(diào)控基因下調(diào)了主效應(yīng)基因TBX1 的編碼功能。

染色體22q11.2 微缺失患兒臨床表征復(fù)雜多樣，除了先心病外通常有免疫力低下、甲狀旁腺發(fā)育不良、語(yǔ)言功能障礙異常等［12］?；純撼錾笮杌ㄙM(fèi)巨額的費(fèi)用進(jìn)行治療，術(shù)后死亡率及并發(fā)癥較未攜帶該缺失的患兒高［13］。89.7%的患兒智力落后和學(xué)習(xí)困難，同時(shí)患兒成年后精神分裂癥、冠心病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)也比正常人增高［14-15］。上述癥狀通常隨著年齡增長(zhǎng)逐漸顯現(xiàn)及加重，因此早期有效的診斷染色體22q11.2 微缺失十分重要，這有利于對(duì)重癥者進(jìn)行早期干預(yù)，對(duì)降低出生缺陷具有重要意義。

綜上所述，先天性心臟病與染色體22q11.2 微缺失綜合征之間關(guān)系密切。對(duì)于超聲篩查提示先心臟病的患兒應(yīng)警惕是否存在染色體22q11.2 微缺失，建議在孕婦知情同意的情況下行侵入性產(chǎn)前檢查，從分子水平上明確先心病的病因。利用產(chǎn)前篩查和產(chǎn)前診斷技術(shù)，及早發(fā)現(xiàn)和干預(yù)先心病患兒，這對(duì)于探索先心病的治療方案和提出針對(duì)性的預(yù)防措施具有重要意義。