王磊 代玉超 李夢 劉紅星，，4★

Venetoclax 是一種BCL-2 通路抑制劑，用于慢性淋巴細(xì)胞白血病/小淋巴細(xì)胞淋巴瘤（chronic lymphocytic leukemia/small lymphocytic lymphoma，CLL/SLL）和急性髓性白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）患者的抗腫瘤治療［1］。體外研究表明Venetoclax 主要由CYP3A4 代謝，與酮康唑、泊沙康唑和利福平等有較強(qiáng)的藥物相互作用，個體間血藥濃度差異較大［2-3］。通過檢測患者Venetoclax 血藥濃度，并個體化地調(diào)整給藥劑量，可減少不良反應(yīng)和保障臨床療效［4-5］。本研究擬建立一種液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）法測定血液病患者血漿Venetoclax 濃度的方案，并應(yīng)用于臨床治療藥物監(jiān)測，為Venetoclax 的個體化用藥劑量調(diào)整提供可靠依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 分析儀器

島津NexeraXp 型高效液相色譜儀（日本島津公司），API3200 MD 三重四級桿質(zhì)譜儀（美國AB SCIEX 公司），質(zhì)譜儀采用電噴霧（ESI）離子源，分析軟件為Analyst?MD 1.6.3。

1.1.2 試劑

標(biāo)準(zhǔn)品：Venetoclax（批號：1-NWY-41-1，TORONTO RESEARCH CHEMICALS INC，加拿大）；內(nèi)標(biāo)：Venetoclax-d8（批號：02-Jun-17-01，Clearsynth，印度）。甲醇（HPLC-Grade，fisher，美國），乙腈（HPLCGrade，fisher，美國），DMSO（二甲基亞砜，Lot：WXBC1590V，西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司），甲酸（HPLC Grade，北京邁瑞達(dá)科技有限公司）；乙酸銨（HPLC Grade，北京邁瑞達(dá)科技有限公司）。

1.1.3 基質(zhì)及臨床樣本

空白血漿基質(zhì)為新鮮小牛血清（北京百奧萊博科技有限公司）。收集本院7 名服用Venetoclax的CLL 患者的血液樣本，均為300 mg qd 服藥，于服藥6 h 時抽血檢測峰濃度。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件

采用月旭Ultimate@XB-C18液相色譜柱（4.6×50 mm，5μm），柱溫60℃；流速：0.7 mL·min-1；液相流動相為：A 相為含2 mmol·L-1乙酸銨+0.1%甲酸的水溶液；B 相為含0.1%甲酸的甲醇溶液。樣本進(jìn)樣量為3 μL。洗脫方式為梯度洗脫，B 相濃度從（0.01～1.0）min 由60%～95%，從（1.0～2.5）min 維持95%濃度，從（2.5～2.6）min，B 相濃度由95%～60%，維持60%濃度到3.5 min 結(jié)束。

1.2.2 質(zhì)譜條件

選用電噴霧離子源（ESI+），以多離子反應(yīng)監(jiān)測方式（MRM）進(jìn)行檢測。其離子源參數(shù)為離子噴射電壓：4 500 V，離子源溫度：550℃，噴霧氣：50 psi，輔助加熱氣：55 psi，氣簾氣：20 psi，碰撞氣：Medium。同時監(jiān)測Venetoclax m/z 868.5～321.7 作為定量離子，Venetoclax m/z 868.5～177.6 作為定性離子；監(jiān)測Venetoclax-d8m/z 876.6～329.4 作為內(nèi)標(biāo)定量離子。見圖1、表1。

圖1 Venetoclax 與Venetoclax-d8 的二級質(zhì)譜圖Figure 1 Secondary mass spectrometry of Venetoclax and Venetoclax-d8

表1 質(zhì)譜條件Table 1 Mass spectrometry conditions

1.2.3 溶液配制

1.2.3.1 儲備液的配制 取Venetoclax 標(biāo)準(zhǔn)品5.000 mg，用DMSO 充分溶解，配制成濃度為0.5 mg·mL-1的儲備液；同樣取Venetoclax-d8標(biāo)準(zhǔn)品1.000 mg，選用DMSO 與甲醇溶劑，充分溶解，配制成濃度為100 μg·mL-1溶液，分裝，備用。

1.2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)品與內(nèi)標(biāo)溶液的配制 取0.5 mg·mL-1的Venetoclax 儲備液，用有機(jī)溶液（50%乙腈+10%DMSO）稀釋成濃度為0.1、0.5、1、2、5、10、20 μg·mL-1的Venetoclax 標(biāo)準(zhǔn)品系列溶液。然后取配置好的Venetoclax-d8儲備液，用甲醇稀釋，制得濃度為250 ng·mL-1Venetoclax-d8內(nèi)標(biāo)溶液。

1.2.4 樣品處理

將患者血液樣本3 500 r·min-1離心10 min，取100 μL 血漿上清，加至1.5 mL 離心管中，加入100 μL 含0.1%甲酸和2 mmol·L-1乙酸銨的水溶液，再加入300 μL 配制好的Venetoclax-d8內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋60 s，充分混勻，13 000 r·min-1離心10 min。吸取上清液于進(jìn)樣瓶中，進(jìn)樣3 μL。

1.2.5 方法學(xué)驗證［6-9］

1.2.5.1 專屬性考察 采用上述實驗方法，分別取空白血漿、加入Venetoclax及Venetoclax-d8的空白血漿、給藥后的患者血漿。按“1.2.4”項方法操作，進(jìn)行檢測。

1.2.5.2 殘留驗證 在分析高濃度樣品后，立即測定空白樣品來評價方法殘留。

1.2.5.3 基質(zhì)效應(yīng)評價 分別添加3 個濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液到空白血漿和水中，按1.2.4 項進(jìn)行處理，通過血漿存在下目標(biāo)化合物（內(nèi)標(biāo)）的信號強(qiáng)度與水中目標(biāo)化合物（內(nèi)標(biāo)）的信號強(qiáng)度來計算內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)因子，進(jìn)而評價基質(zhì)效應(yīng)，計算公式參照中國藥典［9］。

1.2.5.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制和定量限 取10 μL 濃度為0.1、0.5、1、2、5、10、20 μg·mL-1的Venetoclax 標(biāo)準(zhǔn)品系列溶液，分別加入1.5 mL 離心管中，再平行加入90 μL 空白血漿，然后按照1.2.4 操作，經(jīng)HPLC-MS/MS 分析，以Venetoclax 與內(nèi)標(biāo)Venetoclax-d8峰面積之比（Y）作縱坐標(biāo)，以血漿Venetoclax 濃度X為橫坐標(biāo)，用加權(quán)（W=1/X2）最小二乘法進(jìn)行回歸和線性擬合。

1.2.5.5 線性評價

通過評價3 條標(biāo)準(zhǔn)曲線，每天1 條標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算線性回歸的相關(guān)系數(shù)r，要求r≥0.99。

1.2.5.6 精密度 制備高、中、低（1 500，300，30 ng·mL-1）3 種濃度的質(zhì)量控制（quality control，QC）樣品各6 個，按1.2.4 項下進(jìn)行處理，連續(xù)測定3 d，根據(jù)QC 樣品測定濃度結(jié)果計算批內(nèi)和批間精密度，要求CV＜15%。

1.2.5.7 回收率 取空白血漿，制備高、中、低3 個質(zhì)量濃度的質(zhì)控血漿樣品，各6 個，按1.2.4 項下進(jìn)行處理，測定得到分析物及內(nèi)標(biāo)峰面積數(shù)值比值A(chǔ)1；同時取空白血漿，經(jīng)蛋白沉降處理得血漿上清，然后制備高、中、低3 個質(zhì)量濃度的質(zhì)控血漿上清樣品，各6個，按1.2.4 項下進(jìn)行處理，測定得到分析物及內(nèi)標(biāo)峰面積數(shù)值比值A(chǔ)2，以A1/A2比值計算提取回收率。

1.2.5.8 穩(wěn)定性試驗 配制Venetoclax 低、中、高3個濃度（30，300，1 500 ng·mL-1）的血漿樣品，每個濃度3 個樣品，考察其在室溫放置12 h、冰箱4 度放置12 h、進(jìn)樣板放置12 h、反復(fù)凍融3 次穩(wěn)定性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料中正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用（±s）表示，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）進(jìn)行描述；計數(shù)資料采用n（%）表示，結(jié)合方法學(xué)要求對性能驗證實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 專屬性考察

Venetoclax 保留時間為1.88 min，內(nèi)標(biāo)Venetoclax-d8保留時間為1.83 min，二者色譜行為一致；空白血漿中內(nèi)源性物質(zhì)無出峰。見圖2。

圖2 Venetoclax 和Venetoclax-d8色譜圖Figure 2 Chromatogram of Venetoclax and Venetoclax-d8z

2.2 殘留驗證

Venetoclax殘留在3%左右，小于分析物定量下限20%，內(nèi)標(biāo)殘留為0，低于內(nèi)標(biāo)峰面積的5%。見表2。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)評價

有或無血漿基質(zhì)中不同加標(biāo)濃度Venetoclax內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)因子在0.93～1.00 之間，CV 在4%～9%之間，小于15%。見表3。

表2 Venetoclax 殘留實驗評價結(jié)果Table 2 Residual experiment evaluation results of Venetoclax

表3 Venetoclax 基質(zhì)效應(yīng)考察評價結(jié)果Table 3 Matrix effect evaluation results of Venetoclax

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制和定量限

采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析，得到的直線方程為Y=0.002 01X+0.001 64，r=0.999 5。表明Venetoclax 在10～2 000 ng·mL-1內(nèi)線性關(guān)系良好，最低定量限為2 ng·mL-1。

2.5 線性評價

Venetoclax 連續(xù)3 個批次標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別為Y=0.001 89X+0.000 526，r=0.995；Y=0.002 01X+0.001 64，r=0.999 5；Y=0.001 75X+0.006 63，r=0.998 8。表明每批標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)r≥0.990，三條線性數(shù)據(jù)整合通過統(tǒng)計學(xué)方法計算得到線性方程Y=0.001 87X+0.003 15，r=0.996 7。

2.6 精密度

Venetoclax 批內(nèi)RSD 為2.77%～6.10%，批間RSD 為4.91%～5.23%，二者均小于15%，結(jié)果精密度好，數(shù)據(jù)較集中。見表4。

2.7 回收率

Venetoclax 和Venetoclax-d8的面積比例系數(shù)數(shù)值進(jìn)行計算，得回收率在101.68%～105.38%之內(nèi)，位于85%～115%之間。見表5。

2.8 穩(wěn)定性試驗

在以上考察的穩(wěn)定性條件下，對結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，其Venetoclax 濃度數(shù)據(jù)0.92%≤RSD≤6.56%＜15%。見表6。

表4 Venetoclax 精密度測定結(jié)果（n=6）Table 4 Precision measurement results of Venetoclax（n=6）

表5 Venetoclax 回收率測定結(jié)果（n=6）Table 5 Recovery results of Venetoclax（n=6）

表6 Venetoclax 穩(wěn)定性實驗結(jié)果（n=3，±s）Table 6 Stability experiment results of Venetoclax（n=3，±s）

表6 Venetoclax 穩(wěn)定性實驗結(jié)果（n=3，±s）Table 6 Stability experiment results of Venetoclax（n=3，±s）

放置條件濃度（ng/mL）室溫放置12 h冰箱4 度放置12 h進(jìn)樣板放置12 h凍融穩(wěn)定性測得濃度（ng/mL）RSD（%）測得濃度（ng/mL）RSD（%）測得濃度（ng/mL）RSD（%）測得濃度（ng/mL）RSD（%）30 36.37±0.72 1.99 34.90±1.56 4.48 33.13±1.42 4.27 33.57±1.76 5.25 300 330.33±3.06 0.92 324.00±7.94 2.45 319.00±8.66 2.71 321.33±7.51 2.34 1500 1490.00±26.46 1.78 1526.67±51.32 3.36 1416.67±92.92 6.56 1540.00±43.59 2.83

2.9 臨床應(yīng)用

應(yīng)用上述建立的HPLC-MS/MS 法對血漿Venetoclax 濃度進(jìn)行檢測，得到7 例患者Venetoclax 血藥濃度結(jié)果分別為：654、940、398、760、406、1110 和1870 ng·mL-1，可看出同一劑量下不同患者中，其血藥濃度差別較大，但其平均值為877 ng·mL-1，與其藥代動力學(xué)結(jié)論一致。

3 討論

Venetoclax 與三唑類等藥物聯(lián)用時，其體內(nèi)過程受三唑類藥物影響較大，患者易出現(xiàn)惡心，腹瀉，血小板減少等不良反應(yīng)，應(yīng)在Venetoclax 相應(yīng)治療周期內(nèi)減少Venetoclax 劑量［10］。臨床建議實驗室開展Venetoclax血藥濃度檢測，以便臨床更好的調(diào)整Venetoclax給藥劑量。血藥濃度測定方法一般有色譜法，免疫法和HPLC-MS/MS 法。目前關(guān)于Venetoclax 血藥濃度測定的文獻(xiàn)較少，且其方法均為HPLC-MS/MS法。

Salem［11］和Liu 等［12］于2017年建立了測定Venetoclax 血藥濃度的HPLC-MS/MS 法，但他們報道的方法前處理過程復(fù)雜、耗時長，且重復(fù)性不好、效率低；流動相為乙腈/甲酸銨水溶液，色譜柱較長，分析時間長，且無合適的內(nèi)標(biāo)可選擇。Inturi等［13］于2018年報道的方法用同位素Venetoclax-d8作為內(nèi)標(biāo)，但分析時間較長（每個樣品需13 min）；其采用揮發(fā)性太強(qiáng)且不安全的乙醚溶解Venetoclax。本文采用二甲基亞砜溶解Venetoclax，以克服Venetoclax 本身溶解性差的難題。本文采用在血漿中加入100 μL 含0.1%甲酸和2 mmol·L-1乙酸銨的水溶液作為前處理液，甲醇沉淀蛋白效果更好，回收率更高且樣本檢測更穩(wěn)定。實驗數(shù)據(jù)證明，本文建立的Venetoclax 血藥濃度檢測方法專屬性強(qiáng)、精密度好、準(zhǔn)確度高、穩(wěn)定性好、線性范圍寬、無殘留，同時具有前處理簡單，耗時短，重復(fù)性好等特點(diǎn)，可用于臨床常規(guī)血藥濃度測定。

鑒于目前Venetoclax 血藥濃度監(jiān)測在臨床治療藥物監(jiān)測中尚無相關(guān)指南或共識可供借鑒，故本實驗建議臨床可參考其藥物代謝動力學(xué)參數(shù)來進(jìn)行調(diào)整Venetoclax 給藥劑量［1-5，10-17］。一般建議在低脂肪餐條件下，Venetoclax 400 mg qd 劑量，在服藥后6 h（峰值）左右抽血送檢。Venetoclax 穩(wěn)態(tài)Cmax為2.1±1.1 μg·mL-1，可作為臨床調(diào)整劑量的依據(jù)。當(dāng)Venetoclax 與中強(qiáng)度CYP3A 抑制劑及誘導(dǎo)劑和P-gp 抑制劑聯(lián)用，或患者服用的藥物來源不清時，最好監(jiān)測血藥濃度。通過對Venetoclax 整個治療周期不同給藥劑量下血藥濃度結(jié)果回顧性分析，統(tǒng)計出相應(yīng)的血藥濃度有效范圍，可為臨床合理用藥提供參考依據(jù)。