黃珮琪 陸小霞 陳和斌 杜慧 李穎 陳紅衛(wèi)

社區(qū)獲得性肺炎（community acquired pneumonia，CAP）是兒童期常見感染性疾病，也是5 歲以下兒童死亡的首位病因［1］。由于小兒肺功能發(fā)育不完全、抵抗力較弱，7%～13%肺炎可發(fā)展為重癥肺炎，給家庭帶來沉重負擔(dān)［2-3］。目前常用檢查方法有傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)、核酸擴增檢測、分子免疫學(xué)檢查等，但這些檢測方法存在樣本處理過程復(fù)雜、花費時間長、病原體檢測種類少等缺點［4］。宏基因組二代測序（Metagenomic next generation sequencing，mNGS）是一種不依賴于分離培養(yǎng)的新興病原體檢測技術(shù)［5］。以其不需培養(yǎng)、鑒定速度快、準(zhǔn)確率高等優(yōu)點逐步應(yīng)用于感染性疾病領(lǐng)域［6］。本研究對219 例社區(qū)獲得性重癥肺炎患兒的病原學(xué)mNGS 資料進行分析，旨在為臨床診斷提供理論依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年12月至2020年6月武漢兒童醫(yī)院收治住院治療的219 例社區(qū)獲得性重癥肺炎患兒臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有患兒均參照中華醫(yī)學(xué)會兒科學(xué)分會呼學(xué)組制定的《兒童社區(qū)獲得性肺炎管理指南（2013 版）》［7］。②患兒均有行支氣管鏡術(shù)的適應(yīng)癥［8］，并與家長簽署支氣管鏡檢查的知情同意書，且家長同意行mNGS 檢查。③臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①因其他原因入院，院內(nèi)發(fā)展為重癥肺炎；②合并其他免疫缺陷疾病。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 方法

所有患兒入院當(dāng)天采樣，完善血常規(guī)、CRP、PCT、（1，3）-β-D 葡聚糖檢測（G 試驗）、半乳甘露聚糖檢測（GM 試驗）、肺炎支原體抗體等檢查。219 例患兒均進行支氣管鏡檢查，采集其肺泡灌洗液并分為兩份，一份送檢一般細菌涂片及培養(yǎng)，另一份送檢mNGS，標(biāo)本轉(zhuǎn)運符合規(guī)范要求。

1.3 設(shè)備與檢測方法

采取合格樣本，送至華大基因測序儀平臺（深圳華大基因股份有限公司，型號：BGISEQ-50）進行檢測，經(jīng)DNA 提取、文庫構(gòu)建和測序，測序數(shù)據(jù)下機后去除低質(zhì)量和長度小于35 bp 的數(shù)據(jù)以獲得高質(zhì)量的數(shù)據(jù)。通過BWA（BWA：http：//bio-bwa.sourceforge.net/）比對將高質(zhì)量數(shù)據(jù)中比對上人參考基因組序列的數(shù)據(jù)去除。剩下的數(shù)據(jù)在去除低復(fù)雜度reads 后與專用4 個微生物大數(shù)據(jù)庫比對，獲得能夠匹配到某種病原體的序列數(shù)，根據(jù)序列數(shù)的高低以及臨床其它檢測來判斷可能的病原體。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 26.0 統(tǒng)計學(xué)分析；計量資料以（±s）表示，兩組間采用t檢驗；計數(shù)資料以n（%）表示，行χ2檢驗；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 mNGS 與傳統(tǒng)實驗室病原檢出分析

2.1.1 病原檢出情況

219 例送檢標(biāo)本中mNGS 共檢出陽性病例190例（86.76%）；而傳統(tǒng)實驗室病原共檢出陽性病例173 例（78.99%），兩種檢測方法比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=4.649，P＜0.05）。見表1。

2.1.2 年齡分布

mNGS 和傳統(tǒng)實驗室病原病原總檢出率在各年齡段之間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=76.488 7，P＜0.05）。見圖1。

2.2 肺泡灌洗液mNGS 與傳統(tǒng)實驗室病原診斷兒童重癥肺炎病原學(xué)診斷結(jié)果

mNGS 與傳統(tǒng)實驗室病原學(xué)檢測均陽性患者163 例，mNGS 與傳統(tǒng)實驗室病原學(xué)檢測均陰性患者22 例，mNGS 陽性而傳統(tǒng)實驗室病原學(xué)檢測陰性患者27 例，mNGS 陰性而傳統(tǒng)實驗室病原學(xué)檢測陽性患者7 例。

2.3 肺泡灌洗液mNGS 與傳統(tǒng)實驗室病原診斷兒童重癥肺炎病原學(xué)靈敏度、特異度

mNGS 與傳統(tǒng)實驗室病原診斷兒童重癥肺炎病原學(xué)靈敏度、特異度比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

3 討論

現(xiàn)臨床對于微生物分離培養(yǎng)技術(shù)依賴病原體活力；但由于病灶受纖維組織包圍影響及抗生素的應(yīng)用，陽性培養(yǎng)率較低，無法滿足快速、準(zhǔn)確診斷感染需求［7-8］。mNGS 是臨床中新推出的病原學(xué)檢測方式，其只需提取患兒少量DNA 即可快速檢測鑒定病

表1 不同年齡組患兒二代測序及傳統(tǒng)實驗室病原檢出情況及病原體類型［n（%）］Table 1 Second generation sequencing and traditional laboratory pathogen detection and pathogen types in children of different age groups［n（%）］

續(xù)表1Continued Table 1

圖1 不同年齡段患兒病原檢出情況Figure 1 Detection of pathogens in children of different ages

表2 肺泡灌洗液mNGS 與傳統(tǒng)實驗室病原診斷兒童重癥肺炎病原學(xué)靈敏度、特異度（%）Table 2 sensitivity and specificity of alveolar lavage fluid（BALF）mngs and traditional laboratory pathogens in the diagnosis of severe pneumonia in children（%）

原體；具有其通量高、敏感性高、無偏倚等優(yōu)勢。本研究顯示，采用mNGS 檢測重癥肺炎病原檢出率達86.76%，略高于上海［9］、南京［10］等地的報道。且病原檢出以病毒檢出率最高，其次為細菌、肺炎支原體、真菌等。與房亞菲等［11］收集了586 例社區(qū)獲得性肺炎患兒的病原學(xué)資料檢出病原結(jié)構(gòu)相似。

而病毒病原學(xué)診斷中，mNGS 共檢出病毒陽性者149 例，其中135 例腺病毒7 型陽性。孫永烽等［12］分析了2016 至2017年198 例重癥肺炎患兒病原學(xué)特點，結(jié)果發(fā)現(xiàn)呼吸道合胞病毒最多見，腺病毒排第二，明顯低于本研究結(jié)果?？紤]腺病毒感染具有明顯季節(jié)性，且與地域有關(guān)。本研究取樣期間武漢市兒童呼吸道主要流行病原為腺病毒7 型，故樣本中腺病毒7 型占主要比例。腺病毒7型作為腺病毒目前已知的100 多個基因型之一，具有組織嗜性廣特點。其嚴(yán)重時可致多臟器功能障礙，誘發(fā)病死率高［13］。目前尚無針對腺病毒7 型感染后遺癥的有效治療方案。因此，對于重癥腺病毒肺炎，早期使用mNGS 不僅有助于在病程早期階段確診病原，及時治療，減少后遺癥的產(chǎn)生。還可以判斷是否有混合感染，避免不必要的抗生素使用，造成耐藥的情況。

另本研究對比mNGS 以及傳統(tǒng)實驗室病原檢測結(jié)果與傳統(tǒng)ELISA 檢查比較，mNGS 對于病毒的檢測能夠有效的克服前者缺陷，對于病毒抗體的檢測達到精確性和及時性。郭瑋等［14］對198 例重癥肺炎患兒進行病原學(xué)分析，革蘭陽性菌中，同樣以肺炎鏈球菌及金黃色葡萄球菌為主。而革蘭陰性菌中，則以鮑曼不動桿菌及肺炎克雷伯桿菌為主，流感嗜血桿菌僅排第四。本研究結(jié)果與之有部分差異，考慮可能與不同地區(qū)，不同季節(jié)氣候，也可能與入院前抗生素的使用有關(guān)。故使用mNGS 能夠更加精確地診斷重癥肺炎，從而對臨床的實際治療進行科學(xué)的指導(dǎo)。但進行mNGS 檢測時臨床上缺乏標(biāo)準(zhǔn)化流程，且對檢測者技術(shù)要求極高，因此檢測醫(yī)師應(yīng)嚴(yán)格把握二代測序的適用條件，避免出現(xiàn)誤診。

綜上所述，二代測序技術(shù)較傳統(tǒng)實驗室病原檢測可快速檢測重癥肺炎患兒病原學(xué)診斷，指導(dǎo)臨床早期合理用藥。