孫楠 于婷 張文新 賈崢 黃杰 曲守方

腫瘤免疫治療是通過(guò)激發(fā)或調(diào)動(dòng)機(jī)體自身的免疫系統(tǒng)，解除腫瘤細(xì)胞對(duì)于自身免疫系統(tǒng)的抑制，達(dá)到調(diào)控和殺傷腫瘤細(xì)胞的目的。免疫治療這種全新的治療模式也為腫瘤患者帶來(lái)了新的機(jī)遇。其中免疫檢查點(diǎn)抑制劑（Immune Checkpoint Inhibitor，ICI）給惡性腫瘤治療帶來(lái)了新的選擇，包括程序性死亡受體1（PD-1）抑制劑及其配體（PDL1）抑制劑，以及細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4（CTLA-4）抑制劑等［1-2］。腫瘤突變負(fù)荷（tumour mutation burden，TMB）是預(yù)測(cè)患者對(duì)免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療反應(yīng)的新興生物標(biāo)志物，識(shí)別可能受益于免疫治療的腫瘤患者［3-4］。已有研究表明，與低TMB 相比，高TMB 患者的免疫治療效果更好［5-6］。

常見(jiàn)的TMB 檢測(cè)方法是對(duì)腫瘤組織切片或血液標(biāo)本進(jìn)行高通量測(cè)序（Next-generation sequencing，NGS），包括全外顯子（Whole Exome Sequencing，WES）測(cè)序和試劑盒（Panel）靶向測(cè)序等方法［7-8］。雖然腫瘤組織全外顯子測(cè)序是公認(rèn)的檢測(cè)TMB 的金標(biāo)準(zhǔn)，但其測(cè)序成本較高、周期長(zhǎng)，并且對(duì)腫瘤組織標(biāo)本大小和腫瘤細(xì)胞含量有較高要求，在臨床實(shí)踐中難以廣泛使用。國(guó)內(nèi)外有多家體外診斷試劑公司都在二代測(cè)序平臺(tái)上開(kāi)發(fā)了TMB 檢測(cè)試劑盒（Panel），用經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的panel 算法來(lái)計(jì)算TMB，期望替代全外顯子測(cè)序。中國(guó)食品藥品檢定研究院（簡(jiǎn)稱中簡(jiǎn)院）建立腫瘤突變負(fù)荷檢測(cè)（TMB）國(guó)家參考品，包括高置信單核苷酸多態(tài)性和插入缺失（Single nucleotide polymorphisims/insertion-deletion，SNP/Indel）位點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)集，用來(lái)考察試劑盒（Panel）的位點(diǎn)檢測(cè)準(zhǔn)確性。

1 材料與方法

1.1 樣本

腫瘤突變負(fù)荷檢測(cè)國(guó)家參考品由簡(jiǎn)稱中檢院提供。

1.2 試劑與儀器

核酸純化試劑和TMB 檢測(cè)試劑盒（可逆末端終止測(cè)序法），購(gòu)自南京世和醫(yī)療器械有限公司；KAPA Library Quant Kit（illumina）Universal qPCR Mix，購(gòu)自KAPA Biosystems 公司；測(cè)序試劑盒，購(gòu)自Illumina 公司。超聲破碎儀，購(gòu)自Diagenode 公司；Qubit?4.0 熒光定量?jī)x，購(gòu)自Life Technology 公司；Nextseq 550 DX 測(cè)序儀，購(gòu)自Illumina 公司。

1.3 方法

腫瘤突變負(fù)荷檢測(cè)國(guó)家參考品中TMB-14 樣本，是來(lái)自不同人體且是非腫瘤組織的1 對(duì)細(xì)胞系。將這對(duì)細(xì)胞按照不同體積比例進(jìn)行混合，1 個(gè)細(xì)胞（TMB-H）基因組DNA 所占的體積比例分別為0%、1%、2%、5%和10%，其配對(duì)細(xì)胞（TMB-BL）基因組DNA 所占的體積比例分別為100%、99%、98%、95%和90%。取不同體積比例的TMB-14 樣本基因組DNA，用TMB 檢測(cè)試劑盒（可逆末端終止測(cè)序法）進(jìn)行檢測(cè)?；蚪MDNA 經(jīng)超聲片段化處理，進(jìn)行末端修復(fù)和文庫(kù)接頭連接。將文庫(kù)擴(kuò)增后進(jìn)行雜交捕獲富集，洗脫掉未富集的片段后進(jìn)行擴(kuò)增。最后將標(biāo)準(zhǔn)化文庫(kù)上機(jī)測(cè)序。下機(jī)后按照國(guó)家參考品說(shuō)明書(shū)，根據(jù)panel 檢測(cè)的bed 文件，將試劑盒panel 檢測(cè)的VCF 文件與TMB-14 樣本的高置信SNP/Indel 位點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)集進(jìn)行比對(duì)分析，評(píng)價(jià)腫瘤突變負(fù)荷位點(diǎn)檢測(cè)準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果

panel 檢測(cè)的VCF 文件與標(biāo)準(zhǔn)集比對(duì)后，TMB-14-2%、TMB-14-5%、TMB-14-10%的突變檢測(cè)準(zhǔn)確性分別為89.00%、95.20%、95.80%，符合TMB-14-2%、TMB-14-5%、TMB-14-10%國(guó)家參考品應(yīng)分別不低于40%、60%、80%的要求。TMB-14 樣本的高置信SNP/Indel 位點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)集和試劑盒panel 檢測(cè)的SNP/Indel 位點(diǎn)比對(duì)。見(jiàn)表1、圖1～2。

表1 TMB 檢測(cè)國(guó)家參考品結(jié)果Table1 ResultsofnationalreferencematerialforTMBdetection

圖1 國(guó)家參考品高置信SNP 位點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)集與試劑盒SNP的比對(duì)結(jié)果Figure 1 Comparison results of high confidence SNP site standard set in the national reference material and SNP by kit

圖2 國(guó)家參考品高置信Indel 位點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)集與試劑盒Indel比對(duì)結(jié)果Figure 2 Comparison results of high confidence Indel site standard set in the national reference material and Indel by kit

3 討論

隨著二代測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，對(duì)腫瘤治療理念的創(chuàng)新，從腫瘤的分型逐漸引入了分子分型的理念，重視腫瘤的分子靶向治療，實(shí)現(xiàn)異癌同治、同癌異治，美國(guó)食品和藥物管理局（FDA）突破性的批準(zhǔn)了泛癌種的二代測(cè)序技術(shù)的腫瘤基因突變檢測(cè)panel。2017年11月30日美國(guó)FDA 批準(zhǔn)上市FoundationOne CDx 伴隨診斷產(chǎn)品，針對(duì)324 個(gè)基因進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)的突變類型包括替換、插入、缺失、拷貝數(shù)變化、基因重排等突變，以及微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）和TMB 檢測(cè)，適用的樣品類型為福爾馬林固定石蠟包埋組織樣本（FFPE）［9-11］。但是我國(guó)尚未批準(zhǔn)用于TMB 檢測(cè)的伴隨診斷試劑產(chǎn)品。我國(guó)已經(jīng)有多個(gè)公司在NGS 平臺(tái)上開(kāi)發(fā)TMB 檢測(cè)試劑盒，但是至今尚未進(jìn)入審批階段。目前TMB 缺乏統(tǒng)一的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，研制相應(yīng)的國(guó)家參考品，開(kāi)展TMB 相關(guān)應(yīng)用技術(shù)以及標(biāo)準(zhǔn)化研究，可以為TMB 檢測(cè)試劑的申報(bào)奠定工作基礎(chǔ)。

2019年中檢院建立TMB 檢測(cè)國(guó)家參考品，開(kāi)展國(guó)內(nèi)TMB 試劑盒（panel）的性能評(píng)價(jià)工作。對(duì)于TMB 檢測(cè)試劑盒的性能，應(yīng)關(guān)注于兩個(gè)方面：一是試劑盒（panel）的TMB 檢測(cè)一致性，panel 的TMB 檢測(cè)結(jié)果與WES 檢測(cè)結(jié)果的一致性，考察其檢測(cè)TMB 準(zhǔn)確性；二是試劑盒的差異性SNP/Indel位點(diǎn)檢測(cè)準(zhǔn)確性評(píng)價(jià)，檢測(cè)SNP/Indel 位點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)集時(shí)能夠拷出的合適的突變位點(diǎn)個(gè)數(shù)，考察試劑盒整體檢測(cè)的準(zhǔn)確性，從而對(duì)TMB 檢測(cè)試劑盒的性能進(jìn)行全方位的評(píng)價(jià)。

而評(píng)價(jià)TMB 試劑盒（panel）的位點(diǎn)檢測(cè)準(zhǔn)確性，需要與高置信SNP/Indel 位點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)集進(jìn)行比對(duì)。美國(guó)的瓶中基因組協(xié)會(huì)（Genome In A Bottle，GIAB）采用五種不同平臺(tái)對(duì)美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所提供的DNA 標(biāo)準(zhǔn)參考品8392（又稱NA24385，HG002）進(jìn)行結(jié)構(gòu)變異標(biāo)準(zhǔn)集構(gòu)建［12-13］。參考國(guó)際建立標(biāo)準(zhǔn)集的方式，本院建立國(guó)家參考品高置信SNP/Indel 位點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)集。首先使用軟件SOAPnuke對(duì)所有原始數(shù)據(jù)進(jìn)行低質(zhì)量過(guò)濾得到有效數(shù)據(jù)，使用軟件BWA+GATK Haplotype Caller 對(duì)各數(shù)據(jù)集分別進(jìn)行變異檢測(cè)，得到兩類文件：（a）gVCF，用于生成候選變異區(qū)間（b）VCF，用軟件GATK VQSR進(jìn)行處理，初步過(guò)濾得到候選變異集。然后合并各平臺(tái)的候選變異集，使用軟件vcf annotate 將各候選變異區(qū)間注釋到合并的變異集上。對(duì)于每一個(gè)候選變異集，隨機(jī)取40 000 個(gè)在候選變異區(qū)間內(nèi)的變異位點(diǎn)作為訓(xùn)練集，使用R 語(yǔ)言包“e1071”中的軟件one-class SVM 進(jìn)行分類，得到各候選變異集的極端變異閾值用于變異篩選。對(duì)于未通過(guò)篩選的變異，在其兩側(cè)加減50 堿基（bp），生成低置信變異區(qū)間。最后合并候選變異區(qū)間，與低置信變異區(qū)間取補(bǔ)集，再與參考基因組非N 區(qū)間取交集，從而建立了TMB-14 樣本的兩種細(xì)胞系有差異的高置信SNP/Indel 位點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)集。研究結(jié)果表明panel 檢測(cè)的VCF 文件與標(biāo)準(zhǔn)集比對(duì)后，TMB-14-2%、TMB-14-5%、TMB-14-10%的突變檢測(cè)準(zhǔn)確性符合國(guó)家參考品TMB-14 樣本的要求。研制的TMB 國(guó)家參考品，能夠滿足腫瘤突變負(fù)荷檢測(cè)試劑盒的位點(diǎn)檢測(cè)準(zhǔn)確性的要求，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。