呂 荼，王新剛，黃 鵬，黃嵐峰

(1.遼陽市中心醫(yī)院 骨科，遼寧 遼陽111000；2.吉林大學(xué)第二臨床醫(yī)院 骨科)

骨肉瘤屬于原發(fā)惡性腫瘤，在所有骨腫瘤中所占比例約為20%，好發(fā)于兒童與青少年[1]。在手術(shù)技術(shù)、輔助放化療方式不斷進(jìn)步條件下，骨肉瘤患者5年生存率已從以往20%升高至60%左右[2]。有報(bào)道稱，大部分骨肉瘤患者死亡直接原因?yàn)槟[瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移，無轉(zhuǎn)移者術(shù)后5年生存率高達(dá)70%，一旦產(chǎn)生轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，5年生存率則降至30%以下[3]。近年來，有報(bào)道m(xù)iR-449a能夠靶向生長(zhǎng)因子受體(c-Met)，對(duì)人體腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲以及轉(zhuǎn)移起到調(diào)控作用[4]。本文主要分析骨肉瘤患者miR-449a表達(dá)水平及其與臨床病理參數(shù)、患者預(yù)后的關(guān)系，希望為臨床提供一定指導(dǎo)依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象選取遼陽市中心醫(yī)院2013年3月至2016年5月收治的108例骨肉瘤患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)與骨肉瘤診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]相符，且經(jīng)術(shù)后病理學(xué)結(jié)果確診；(2)初診初治患者；(3)具有手術(shù)適應(yīng)癥，同意手術(shù)治療；(4)具有完整臨床與隨訪資料；(5)簽署研究知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)哺乳或妊娠期病例；(2)合并重要器官功能障礙、心腦血管疾病、凝血功能障礙、自身免疫功能障礙或者其他惡性腫瘤；(3)入院前已經(jīng)有抗腫瘤治療史；(4)合并精神類疾病。研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審批。取患者骨肉瘤組織為實(shí)驗(yàn)組，瘤旁正常骨組織作為對(duì)照組。

1.2 方法

1.2.1臨床資料調(diào)查 調(diào)查并統(tǒng)計(jì)患者性別、年齡、病灶位置、組織學(xué)分型、腫瘤分期(按照Enneking外科分期)、軟組織浸潤(rùn)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況等。術(shù)后對(duì)患者進(jìn)行4年隨訪，記錄其累積生存率。

1.2.2miR-449a表達(dá)檢測(cè) 采取熒光定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)患者骨肉瘤組織與瘤旁正常骨組織miR-449a表達(dá)水平。首先利用Trizol試劑(購(gòu)自Invitrogen公司)提取凍存組織之中總RNA。采取反轉(zhuǎn)錄試劑盒(購(gòu)自TaKaRa公司)對(duì)所取RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得互補(bǔ)DNA(cDNA)。然后，利用SYBR Green(購(gòu)自TaKaRa公司)予以實(shí)時(shí)PCR分析。 采取ABI7500系統(tǒng)完成qRT-PCR檢測(cè)過程。內(nèi)參選擇U6，U6與miR-449a引物序列具體見表1。

表1 引物序列

PCR具體反應(yīng)體系為：采取10×Buffer與濃度2.5 mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)分別5 μL、4 μL，Pmix與taq酶分別2.5 μL、0.5 μL，上游以及下游引物各1 μL，雙蒸水36 μL。控制反應(yīng)條件為：94℃條件下預(yù)變性2 min，變性 25 s，然后60 ℃退火處理35 s，72℃連續(xù)延伸20 s，總共31個(gè)循環(huán)。通過公式：2-ΔΔCt，得到miR-449a相對(duì)表達(dá)量，該公式中ΔCt=Ct目的基因-CtU6。以骨肉瘤miR-449a相對(duì)表達(dá)量平均值為分界，分為高水平組與低水平組。

2 結(jié)果

2.1 2組miR-449a表達(dá)水平比較實(shí)驗(yàn)組miR-449a表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組(P<0.05)。見表2。高水平miR-449a表達(dá)42例，低水平表達(dá)66例。

表2 2組miR-449a表達(dá)水平比較

2.2 高水平組與低水平組臨床資料比較見表3。miR-449a表達(dá)與患者性別、年齡、病灶位置、組織學(xué)分型無明顯關(guān)系(P>0.05)，與腫瘤臨床分期、軟組織浸潤(rùn)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移關(guān)系明顯(P<0.05)。

表3 高水平組與低水平組臨床資料比較(n)

2.3 miR-449a表達(dá)與患者預(yù)后關(guān)系4年隨訪發(fā)現(xiàn)，miR-449a表達(dá)高水平組生存34例(80.95%)，死亡8例(19.05%)；低水平組生存40例(60.61%)，死亡26例(39.39%)。圖1為Kaplan-Meier生存曲線，低水平組中位生存時(shí)間明顯短于高水平組(P<0.05)，累積生存率顯著低于高水平組(χ2=4.767，P=0.029)。

圖1 miR-449a表達(dá)與預(yù)后關(guān)系

3 討論

骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展和人體多種致癌或者抑癌基因有關(guān)，這些基因表達(dá)異常主要通過調(diào)控細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)移的方式參與腫瘤發(fā)展[6]。以往研究表明，miRNA譜系表達(dá)水平異常與癌癥緊密相關(guān)，如胃癌、骨腫瘤、乳腺癌以及結(jié)腸癌等[7]。故臨床認(rèn)為，腫瘤組織里面miRNA表達(dá)能夠作為患者診治、預(yù)后判定新靶點(diǎn)。

有報(bào)道稱，人體內(nèi)多種miRNA表達(dá)異常和骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展以及轉(zhuǎn)移存在密切聯(lián)系[8]。miR-449集群主要分布在5號(hào)染色體q11.2的細(xì)胞分裂周期蛋白20B抗體(CDC20B)第2個(gè)內(nèi)含子，該區(qū)域是癌癥易感性位點(diǎn)，人體miR-449表達(dá)異常可能與腫瘤病灶產(chǎn)生以及發(fā)展有關(guān)。miR-449集群編碼的成熟miRNAs(包括miR-449a、miR-449b和miR-449c)均能夠?qū)?xì)胞周期阻滯與細(xì)胞凋亡產(chǎn)生介導(dǎo)作用，從而抑制細(xì)胞存活與癌組織生長(zhǎng)[9]。miR-449a屬于細(xì)胞凋亡與分化、細(xì)胞周期阻滯等環(huán)節(jié)有效誘導(dǎo)物，在腫瘤生長(zhǎng)、增殖以及分化中發(fā)揮著重要作用[10-11]。相關(guān)研究指出，miR-449a在骨肉瘤、膠質(zhì)瘤、肺癌以及肝癌等進(jìn)程中主要通過抑制B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(BCL2)的方式誘導(dǎo)凋亡[12]。亦有實(shí)驗(yàn)研究表明，miR-449a可對(duì)癌細(xì)胞增殖產(chǎn)生抑制作用，同時(shí)有效促進(jìn)細(xì)胞凋亡[13]。本研究中，實(shí)驗(yàn)組miR-449a表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組，表明骨肉瘤組織miR-449a表達(dá)下調(diào)，說明骨肉瘤發(fā)生發(fā)展過程中miR-449a可能發(fā)揮抑癌基因作用。有實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明miR-449a表達(dá)上調(diào)可以造成肝癌細(xì)胞凋亡速率升高與增殖減少，如果miR-449a表達(dá)下調(diào)，會(huì)產(chǎn)生相反效果，認(rèn)為miR-449a 表達(dá)情況可能對(duì)胃癌患者病情發(fā)展產(chǎn)生影響[14]。本研究發(fā)現(xiàn)， 高水平組與低水平組在腫瘤臨床分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移以及軟組織浸潤(rùn)等方面有明顯差異，表明miR-449a表達(dá)下調(diào)與腫瘤進(jìn)程、轉(zhuǎn)移與浸潤(rùn)情況有關(guān)，可能由于miR-449a在癌癥患者中對(duì)細(xì)胞周期造成的影響不僅可使蛋白質(zhì)控制紊亂以及生長(zhǎng)因子表達(dá)水平提高，同時(shí)能夠使其受體失調(diào)，以此參與骨肉瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過程。除此之外，miR-449a可以綁定基因啟動(dòng)子，對(duì)其下游信號(hào)通路產(chǎn)生影響，從而控制其活性。BCL2屬于抗凋亡分子，亦為miR-449a直接靶基因，低表達(dá)miR-449a可以通過減弱BCL2表達(dá)的方式促進(jìn)凋亡，從而參與骨肉瘤的發(fā)生與發(fā)展[15-16]。有研究指出，miR-449a高表達(dá)可以明顯改善胃癌患者預(yù)后情況[17]。本文生存分析顯示，低水平組中位生存時(shí)間明顯短于高水平組，表明miR-449a表達(dá)水平與骨肉瘤患者預(yù)后相關(guān)，高水平者預(yù)后較好，可用于骨肉瘤患者預(yù)后評(píng)估。

綜上，骨肉瘤患者瘤組織miR-449a表達(dá)下調(diào)，與患者病理特征(臨床分期、轉(zhuǎn)移及浸潤(rùn)等)有關(guān)，同時(shí)miR-449a低表達(dá)水平和患者不良預(yù)后具有緊密聯(lián)系，能夠用于預(yù)后判定。