高宏杰，劉思鴻，貢磊磊#，張華敏

(1.中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)藥信息研究所黨委辦公室，北京 100700； 2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院藥事部，北京 100026； 3.中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京 100700)

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是世界范圍內(nèi)導(dǎo)致死亡的主要疾病之一，具有發(fā)病率高、預(yù)后差和死亡率高等特點(diǎn)。及時恢復(fù)血流灌注可挽救更多心肌，是AMI患者最有效的治療方法。但再灌注本身會引起心臟的結(jié)構(gòu)和功能損傷，如心肌細(xì)胞損傷、心肌頓抑、心臟功能降低和惡性心律失常。這一現(xiàn)象稱為心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)，即當(dāng)心肌組織和細(xì)胞低灌注缺血一段時間而再次獲得血液供應(yīng)時，缺血損傷沒有減輕或者恢復(fù)，反而加重的現(xiàn)象[1]。MIRI的臨床表現(xiàn)主要有無復(fù)流、心肌頓抑、再灌注心肌壞死和再灌注心律失常。隨著對MIRI的認(rèn)識，學(xué)者們提出了多種MIRI相關(guān)的機(jī)制，包括氧自由基學(xué)說、鈣離子超載、炎癥反應(yīng)、酸堿失衡及線粒體功能障礙等[2-3]。針對MIRI的治療策略主要有非藥物療法和藥物治療策略，非藥物療法有缺血預(yù)適應(yīng)和缺血后預(yù)適應(yīng)；藥物治療策略有再灌注損傷挽救激酶(reperfusion injury salvage kinases，KISA)途徑抑制劑，恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)低pH的藥物和減輕活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS)生成、鈣離子超載的藥物,抗炎化合物，自由基清除劑或抑制劑等[3]。

中醫(yī)理論及臨床研究結(jié)果表明，痰瘀是MIRI發(fā)生發(fā)展過程中的重要病因病機(jī)，MIRI病位在心，與肺、肝、脾關(guān)系密切，肝主疏泄，疏泄不利，則氣血津液流通障礙，生痰飲瘀血；肺主宣降，脾主健運(yùn)，若肺氣不能宣布津液，脾虛不能健運(yùn)水谷，致使痰濁內(nèi)生，痰濁滯于血脈，阻礙營血流布同行[4]。痰瘀相關(guān)學(xué)說是中醫(yī)理論的重要組成部分，以此為基礎(chǔ)提出的痰瘀同治方廣泛應(yīng)用于抗MIRI臨床和基礎(chǔ)研究中[5-6]。痰瘀同治方由赤芍、瓜蔞等藥物組成。唐丹麗等[7]觀察了痰瘀同治方對高血癥MIRI大鼠血脂、血液流變及炎癥的影響，結(jié)果表明，痰瘀同治方可通過降低血脂、改善血液流變及降低炎癥因子含量，發(fā)揮抗MIRI的作用；其作用機(jī)制可能與通過調(diào)節(jié)核因子κB(NF-κB)信號通路減輕炎癥反應(yīng)有關(guān)；并且在缺血期間痰瘀同治方能夠誘導(dǎo)自噬的表達(dá)，再灌注期間可以抑制其過度反應(yīng)，并在各階段協(xié)同抗凋亡途徑發(fā)揮心肌保護(hù)作用[8]。但痰瘀同治方抗MIRI的深入的分子機(jī)制及其質(zhì)量標(biāo)志物尚未闡明，本研究通過整合藥理學(xué)平臺V2.0(TCMIP V2.0)，對痰瘀同治方抗MIRI可能的分子機(jī)制進(jìn)行深入挖掘并探索可能的質(zhì)量標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1 痰瘀同治方化學(xué)成分來源及藥物靶標(biāo)

本研究采用基于中醫(yī)藥百科全書數(shù)據(jù)庫(the encyclopedia of traditional Chinese medicine，ETCM)[9](http://www.tcmip.cn/ETCM/index.php/Home/Index/)的中醫(yī)藥TCMIP V2.0(http://www.tcmip.cn/TCMIP/index.php/Home/Login/login.html)[10]“中藥材數(shù)據(jù)庫”搜集痰瘀同治方中11味中藥的化學(xué)成分信息，構(gòu)建痰瘀同治方化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫，并根據(jù)相應(yīng)的化學(xué)成分信息，利用平臺中“中藥靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫”，收集痰瘀同治方中中藥材對應(yīng)的靶標(biāo)。并對藥物潛在靶標(biāo)進(jìn)行基因本體(gene ontology，GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析。

1.2 MIRI靶標(biāo)收集

對于MIRI疾病靶標(biāo)，本研究利用TCMIP V2.0平臺中“疾病相關(guān)分子庫”，輸入“Myocardial ischemia and reperfusion injury”“Ischemia reperfusion injuries”“Myocardial Reperfusion Injury”和“Myocardial ischemia-reperfusion injury”，收集MIRI疾病靶標(biāo)，對搜集靶標(biāo)去重，建立MIRI靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫。

1.3 痰瘀同治方抗MIRI核心靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)、GO及KEGG富集分析

利用TCMIP V2.0平臺中“中醫(yī)藥關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)挖掘”模塊，構(gòu)建痰瘀同治方中每味中藥成分靶標(biāo)及目標(biāo)疾病MIRI潛在靶標(biāo)之間的相互作用關(guān)系，構(gòu)建“中藥-疾病”關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，通過計算網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的連接度(degree)、介度(betweenness)和緊密度(closeness)，篩選網(wǎng)絡(luò)中前100位靶標(biāo)構(gòu)建核心靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)并實(shí)現(xiàn)核心網(wǎng)絡(luò)可視化。繼而，對核心靶標(biāo)進(jìn)行GO和KEGG富集分析。最后，借助該模快構(gòu)建“中藥-成分-靶標(biāo)-通路”多維網(wǎng)絡(luò)，對網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化分析，挖掘痰瘀同治方中抗MIRI可能的成分，對痰瘀同治方抗MIRI標(biāo)志物進(jìn)行初篩。

1.4 痰瘀同治方抗MIRI分子機(jī)制及其質(zhì)量標(biāo)志物分析

通過對多維網(wǎng)絡(luò)中藥成分參與的生物學(xué)過程及其可能通路進(jìn)行分析，并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)探討痰瘀同治方抗MIRI可能的分子機(jī)制。此外，質(zhì)量標(biāo)志物由劉昌孝院士首先提出，從質(zhì)量傳遞與溯源、成分特有性、成分有效性、成分可測性以及復(fù)方配伍環(huán)境5個方面確定藥材質(zhì)量標(biāo)志物[11]。本研究以上述5個方面為篩選標(biāo)準(zhǔn)，并結(jié)合成分參與的主要生物學(xué)過程為重要依據(jù)，對痰瘀同治方抗MIRI可能的質(zhì)量標(biāo)志物進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 痰瘀同治方藥物化學(xué)成分及靶標(biāo)MIRI靶標(biāo)分析

基于TCMIP V2.0收集痰瘀同治方中赤芍、瓜蔞等藥物化學(xué)成分共157個，通過平臺預(yù)測藥物靶標(biāo)共272個。在TCMIP V2.0中搜集MIRI相關(guān)疾病靶標(biāo)信息，通過查找并去重后，共獲得疾病靶標(biāo)290個。

2.2 痰瘀同治方抗MIRI核心靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)分析

基于TCMIP V2.0“中醫(yī)藥關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)挖掘”模塊，篩選前100位的靶標(biāo)進(jìn)行分析，構(gòu)建核心靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)，在核心網(wǎng)絡(luò)中含疾病靶標(biāo)57個，藥物靶標(biāo)73個，藥物與疾病共有靶標(biāo)共31個。對這31個共有靶標(biāo)進(jìn)行生物信息學(xué)分析。GO富集分析結(jié)果顯示，這些共有靶標(biāo)主要富集于血管生成的正調(diào)控(positive regulation of angiogenesis)、血管形成(angiogenesis)、自噬正調(diào)控(positive regulation of macroautophagy)、脂多糖介導(dǎo)的信號通路(lipopolysaccharide-mediated signaling pathway)、炎癥反應(yīng)(inflammatory response)、凋亡負(fù)調(diào)控(negative regulation of apoptotic process)、細(xì)胞鐵離子穩(wěn)態(tài)(cellular iron ion homeostasis)及內(nèi)皮細(xì)胞增殖的正調(diào)控(positive regulation of endothelial cell proliferation)等過程，見圖1(A)；KEGG富集分析結(jié)果顯示，這些共有靶標(biāo)主要富集于FoxO信號通路(FoxO signaling pathway)、缺氧誘導(dǎo)因子(HIF-1)信號通路(HIF-1 signaling pathway)、胰島素抵抗(Insulin resistance)、腫瘤壞死因子(TNF)信號通路(TNF signaling pathway)、炎癥性腸病(Inflammatory bowel disease，IBD)、PI3K-Akt信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)及血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)信號通路(VEGF signaling pathway)等信號通路，見圖1(B)。

圖1 痰瘀同治方抗MIRI共有靶標(biāo)的GO功能富集分析和KEGG通路富集分析Fig 1 GO function and KEGG pathway enrichment analysis of common targets of Tanyu Tongzhi formula in the treatment of myocardial ischemia reperfusion injury

2.3 痰瘀同治方抗MIRI多維網(wǎng)絡(luò)及藥理作用分析

構(gòu)建痰瘀同治方抗MIRI“成分-靶標(biāo)-通路-藥理作用”多維網(wǎng)絡(luò)，獲得了46個成分，19個共有靶標(biāo)，這些共有靶標(biāo)參與了FoxO信號通路(FoxO signaling pathway)、HIF-1信號通路(HIF-1 signaling pathway)、TNF信號通路(TNF signaling pathway)、PI3K-Akt信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)、VEGF信號通路(VEGF signaling pathway)，共有靶標(biāo)參與的通路主要與炎癥反應(yīng)、血管生成、自噬與凋亡和氧化應(yīng)激等過程有關(guān)，見圖2。

圖2 痰瘀同治方干預(yù)MIRI“成分-靶標(biāo)-通路-藥理作用”多維網(wǎng)絡(luò)分析Fig 2 Multi-dimensional network of “component-target-pathway-pharmacological action” of Tanyu Tongzhi formula in the treatment of myocardial ischemia reperfusion injury

3 討論

《血證論》指出，“須知痰水之壅，由瘀血使然，但去瘀血則痰水自消”，痰瘀互結(jié)是MIRI主要證候之一[12]。痰瘀同治法可以有效抗MIRI，尤以赤芍、瓜蔞等組成的痰瘀同治方是痰瘀同治法應(yīng)用的具體體現(xiàn)。本研究基于TCMIP V2.0發(fā)現(xiàn)痰瘀同治方通過血管生成的正調(diào)控、血管形成、自噬正調(diào)控、脂多糖介導(dǎo)的信號通路、炎癥反應(yīng)、凋亡負(fù)調(diào)控等發(fā)揮其功能，此外，痰瘀同治方通過影響FoxO信號通路、HIF-1信號通路、TNF信號通路、PI3K-Akt信號通路及VEGF信號通路等信號通路參與抗MIRI的過程。多維網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示，山奈酚、槲皮素、異鼠李素、黃芩素、芍藥苷和柚皮素等成分通過作用于KDR、NOS3、VEGF、HIF-1 A、白細(xì)胞介素(IL)6、IL-10、TNF、CASP3及CCL2等共有靶標(biāo)參與PI3K-Akt信號通路、VEGF信號通路、HIF-1信號通路、FoxO信號通路和TNF信號通路。這些共有靶標(biāo)參與的通路主要涉及氧化應(yīng)激、自噬、凋亡、血管生成和炎癥反應(yīng)等環(huán)節(jié)。

氧化應(yīng)激是指機(jī)體在遭受各種有害刺激時，體內(nèi)高活性分子如ROS或活性氮自由基產(chǎn)生過多，氧化程度超出氧化物的清除，氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，從而導(dǎo)致組織損傷。MIRI通過黃嘌呤氧化酶系統(tǒng)，激活的中性粒細(xì)胞和線粒體呼吸鏈異常產(chǎn)生過量的氧自由基[13-15]。大量的ROS介導(dǎo)的氧化應(yīng)激是心肌細(xì)胞死亡、收縮和舒張功能降低的重要始動因素。研究結(jié)果表明，SRIRT1的過表達(dá)通過調(diào)節(jié)糖尿病大鼠內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS或NOS3)活性來減少糖尿病加重的MI/R損傷和氧化應(yīng)激[16]。eNOS是Akt磷酸化后的下游重要底物之一，PI3K/Akt信號通路調(diào)控eNOS的表達(dá)，從而促進(jìn)NO的表達(dá)，減輕對心肌細(xì)胞的損傷，發(fā)揮對MIRI的保護(hù)作用[17]。痰瘀證與冠心病其他證型相比氧自由基明顯有差異[18]，而痰瘀同治方可以通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激改善MIRI。研究結(jié)果顯示，PI3K/Akt信號通路在MIRI發(fā)生進(jìn)展中發(fā)揮保護(hù)心肌細(xì)胞的作用，在MIRI期間，激活PI3K/Akt信號通路后，TNF-α和IL-1β等促炎因子過度表達(dá)受到抑制，PI3K/Akt信號通路通過減輕炎癥反應(yīng)，從而減輕對心肌細(xì)胞的損傷[17]。痰瘀互結(jié)證在C反應(yīng)蛋白(CRP)、TNF-α及IL-6等炎癥相關(guān)因子方面與非痰瘀證的差異有顯著性意義[19]，痰瘀同治方通過影響炎癥相關(guān)生物學(xué)過程改善MIRI損傷。FoxO在MIRI過程中形成PI3K/Akt/FoxO的抗心肌細(xì)胞凋亡通路，F(xiàn)oxO3a在維持心臟功能和拮抗氧化應(yīng)激反應(yīng)中起著重要作用，F(xiàn)oxO3a表達(dá)增加會降低ROS，并促進(jìn)心肌細(xì)胞存活[20]。HIF-1α作為抗缺氧的保護(hù)因子，可以刺激VEGF的轉(zhuǎn)錄，在MIRI期間，通過激活A(yù)kt/HIF-1α/VEGF信號通路促進(jìn)心肌細(xì)胞的存活，抑制MIRI損傷[21]。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，抑制VEGF表達(dá)后可調(diào)節(jié)凝血級聯(lián)反應(yīng)[22]。痰瘀證與非痰瘀證相比，組織纖溶酶原激活物(t-PA)含量降低，組織纖溶酶原激活物抑制物(PAI-1)含量升高，凝血酶原時間(PT)縮短[23]；而痰瘀同治方可以通過VEGF信號通路改善凝血過程。在多維網(wǎng)絡(luò)圖中，發(fā)現(xiàn)NOS3和VEGF作為重要靶標(biāo)參與了PI3K/Akt信號通路、VEGF信號通路和HIF-1信號通路，IL-6參與了PI3K/Akt信號通路、VEGF信號通路、HIF-1信號通路和FoxO信號通路，而AKT1參與了全部5條信號通路。AKTI作為PI3K/Akt信號通路的重要靶標(biāo)，在活化后，通過調(diào)控下游靶標(biāo)mTOR、eNOS、NF-κB及FoxO等蛋白改善MIRI。TNF、CCL2、IL-6及MAPK10等蛋白參與以炎癥反應(yīng)為主的信號通路(TNF信號通路)，在以上共有靶標(biāo)中AKT1發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，既是PI3K/Akt信號通路的重要靶標(biāo)，也能通過調(diào)節(jié)下游靶標(biāo)發(fā)揮MIRI的保護(hù)作用。而黃芩素、山奈酚、柚皮素和槲皮素通過與AKT1作用影響上述5條信號通路。研究結(jié)果表明，黃芩素可減輕MIRI引起的腎損傷，其作用機(jī)制可能與抑制TNF-α，調(diào)節(jié)Bcl2、Bax表達(dá)及激活A(yù)KT有關(guān)[24]。山奈酚通過調(diào)節(jié)MAPK信號通路減輕炎癥和凋亡，進(jìn)而改善MIRI損傷[25]。柚皮素能有效改善心臟功能，同時減輕心肌細(xì)胞的凋亡和梗死，還可以抑制MIRI誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和ER應(yīng)激[26]。槲皮素能夠通過調(diào)節(jié)SIRT1/PGC1-α信號通路，改善MIRI誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡[27]；還可以通過下調(diào)HMGB1-TLR4-NF-κB信號通路減輕MIRI損傷[28]。

結(jié)合運(yùn)用TCMIP V2.0發(fā)現(xiàn)，黃芩素、山奈酚、柚皮素及槲皮素的體內(nèi)吸收和成藥性較好，并且上述4種成分作為有效成分可測性好，槲皮素和山奈酚作為銀杏葉含量測定成分已在《中華人民共和國藥典》中記載[29]。上述4種成分通過與核心靶標(biāo)作用參與MIRI的發(fā)生發(fā)展過程，可候選為痰瘀同治方抗MIRI的質(zhì)量標(biāo)志物。