王 迅，劉 順，鄒愷平，劉月恒，朱廣平

(南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制劑部，江蘇 南京 210029)

腎盂腎炎是一種常見(jiàn)的泌尿系統(tǒng)感染性疾病，分為急性腎盂腎炎(acute pyelonephritis，AP)和慢性腎盂腎炎(chronic pyelonephritis，CP)兩種類型，在急性期如治療不當(dāng)，易復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)為慢性，CP是導(dǎo)致慢性腎功能不全的重要原因。雖然隨著疾病譜的變化，以腎盂腎炎為基礎(chǔ)病變而致慢性腎功能不全的比例在逐漸降低，但該病的發(fā)病率、復(fù)發(fā)率以及AP轉(zhuǎn)CP的發(fā)生率并未見(jiàn)降低[1]?；诖吮尘埃⑴c人類腎盂腎炎相似的動(dòng)物模型，在發(fā)病機(jī)制上正確認(rèn)識(shí)腎盂腎炎，進(jìn)而設(shè)計(jì)出有效治療方案，是一項(xiàng)意義重大且十分必要的研究。AP模型可以用兔、猴、豬、大鼠及小鼠等動(dòng)物來(lái)制作，包括血源性腎盂腎炎、經(jīng)尿道逆行性腎盂腎炎等。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，AP主要是由大腸埃希菌感染，逆向上侵腎盂、腎盞及腎實(shí)質(zhì)，侵染腎臟所引起的急性化膿性炎癥[2-6]。滋腎通關(guān)方來(lái)源于李東垣所著《蘭室秘藏》，是“反佐”配伍的代表方劑。全方由知母、黃柏、肉桂3味中藥組成，功在除下焦?jié)駸幔螂讱饣?，具有滋腎清熱、化氣通關(guān)的功效。方中，知母苦寒，上清肺熱而降火，下潤(rùn)腎燥而滋陰；黃柏苦寒，瀉膀胱相火，補(bǔ)腎水不足，清下焦?jié)駸幔恢?、黃柏兩藥相須而行，滋腎陰之虧損，兼瀉妄動(dòng)之相火，相得益彰；少佐肉桂溫通血脈，補(bǔ)命門(mén)之火，以助膀胱氣化，增強(qiáng)利尿通關(guān)之功，藥性雖溫，起“反佐”之效，三藥同用，相反相成。江蘇省中醫(yī)院制劑部基于該方開(kāi)發(fā)的醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑“滋腎通關(guān)膠囊”在臨床使用十多年，對(duì)于中醫(yī)腎虛濕熱淋證之急性腎盂腎炎、膀胱炎和尿道綜合征的臨床療效顯著[7-10]。因此，本研究擬在建立理想AP動(dòng)物模型基礎(chǔ)上，以白細(xì)胞介素(IL)1α、IL-1β等6種炎癥因子作為檢測(cè)指標(biāo)，通過(guò)比較不同模型組中炎癥因子含量，從系統(tǒng)免疫、細(xì)胞免疫等多角度研究配伍肉桂對(duì)于急性腎盂腎炎的炎癥反應(yīng)的影響，以期解釋反佐配伍的內(nèi)涵，更好地挖掘與開(kāi)發(fā)古方經(jīng)方。

1 材料

1.1 動(dòng)物及飼養(yǎng)環(huán)境

清潔級(jí)Wistar純種大鼠80只，雌雄各半，體重(190±10) g，購(gòu)自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心，許可證號(hào)為SCXK(蘇)-2017-0007。本研究在江蘇省中醫(yī)院臨床藥理研究中心進(jìn)行，動(dòng)物飼養(yǎng)于12 h明暗循環(huán)的屏障系統(tǒng)內(nèi)，符合二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后造模，以排除非健康實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)環(huán)境對(duì)結(jié)果的影響。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中均按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的3R原則給予關(guān)懷。全價(jià)飼料購(gòu)自協(xié)同醫(yī)藥生物工程責(zé)任有限公司，批號(hào)為190122。

1.2 菌種

造模采用大腸埃希菌，品種編碼為CMCC(B)44113，標(biāo)準(zhǔn)菌株購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為44113-11。

1.3 儀器

AX224ZH/E型萬(wàn)分之一電子天平(奧豪斯國(guó)際貿(mào)易(上海)有限公司)；PL-203型電子天平[梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易(上海)有限公司]；BSC-1300ⅡA2型生物安全柜(AirTech蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)； JY92-IIn型超聲細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)；Neofuge 15R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)[力新儀器(上海)有限公司]；FBZ2001-UP-P型純水儀(青島富勒姆科技有限公司)；MX-F型渦旋混合器、KH-Ⅲ型全自動(dòng)研磨儀(武漢塞維爾(Servicebio)生物科技有限公司)；DW-HL398型超低溫冷凍儲(chǔ)存箱(中科美菱低溫科技股份有限公司)；DNP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)； HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市杰瑞爾電器有限公司)；RT3100型自動(dòng)洗板機(jī)(Rayto雷杜生命科學(xué)股份有限公司)；Epoch型酶標(biāo)檢測(cè)儀(BioTeK美國(guó)伯騰儀器有限公司)；1 000、200、50和10 μl移液器及300 μl多道移液器[大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器(北京)股份公司]。

1.4 藥物與試劑

知母(馬鞍山井泉中藥飲片有限公司，批號(hào)為20170201)；黃柏(貴州同德藥業(yè)有限公司，批號(hào)為20161101)；肉桂(安徽大別山中藥飲片公司，批號(hào)為160803)；鹽酸左氧氟沙星片(商品名為維利泰，廣州白云山制藥總廠，批號(hào)為1180020，規(guī)格為0.1 g)；10%水合氯醛溶液(江蘇省中醫(yī)院制劑部生產(chǎn)，批號(hào)為1901001)；麥康凱瓊脂培養(yǎng)基(產(chǎn)品編號(hào)為11307，批號(hào)為1711090)、麥康凱液體培養(yǎng)基(產(chǎn)品編號(hào)為11408，批號(hào)為110925)、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(產(chǎn)品編號(hào)為11104，批號(hào)為181207)，均為北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司生產(chǎn)；哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基(上?？片敿挝⑸锛夹g(shù)有限公司，批號(hào)為181224)。Rat TNF alpha Uncoated 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(賽默飛生物，批號(hào)為222131-001)，Rat IL-6 ELISA試劑盒(聯(lián)科生物，批號(hào)為A30600115)，Rat IL-1β ELISA試劑盒(聯(lián)科生物，批號(hào)為A301B91044)，Rat IL-1α ELISA試劑盒(欣博盛生物，批號(hào)為R200419-009b)， Rat MCP-1 ELISA試劑盒(欣博盛生物，批號(hào)為R200106-113b)，Enzyme-linked Immunosorbent Assay Kit For Chemokine (C-X-C Motif) Ligand 2 (CXCL2)(優(yōu)爾生生物，批號(hào)為L(zhǎng)191211206)。

2 方法

2.1 菌液制備

在(35±1) ℃電熱恒溫培養(yǎng)箱中，以胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基過(guò)夜培養(yǎng)大腸埃希菌CMCC(B)44113標(biāo)準(zhǔn)菌株24 h，將菌懸液倍量稀釋，分別劃線涂布于哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基表面，觀察菌落存活生長(zhǎng)情況，以加樣器稀釋，使菌懸液最終濃度達(dá)1×107cfu/ml。

2.2 模型制備

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[11-20]，結(jié)合實(shí)際操作以及人類急性腎盂腎炎不同性別的實(shí)際發(fā)病比例，本研究采用雌性大鼠不開(kāi)腹單純注射制備AP模型的方法：雌性大鼠禁水12 h后，以10%水合氯醛按0.35 ml/100 g劑量腹腔注射麻醉，將大鼠以仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)，外陰部以75%酒精消毒3次，以無(wú)菌鑷子將尿道口一側(cè)皮膚提起，于尿道中緩慢插入硬膜外導(dǎo)管，待阻力感消失后繼續(xù)向前插入，直至再次出現(xiàn)阻力感(約1～1.5 cm)，以1 ml無(wú)菌注射器針頭插入導(dǎo)管腔內(nèi)注入約大腸埃希菌菌液0.5 ml，拔出導(dǎo)管的同時(shí)迅速夾閉尿道口并以細(xì)線結(jié)扎尿道口，防止菌液溢出，至2 h后松開(kāi)，同時(shí)恢復(fù)正常飲水。

2.3 分組與給藥

選擇雌性大鼠為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛣?dòng)物，隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性藥組、滋腎通關(guān)方組及藥對(duì)組。模型組、陽(yáng)性藥組、滋腎通關(guān)方組及藥對(duì)組大鼠按“2.2”項(xiàng)下方法建立AP模型。由于不同藥物的當(dāng)量不同，以成人1 d服用該藥的總量為參照，根據(jù)大鼠體重，按等效劑量系數(shù)6.3，分別計(jì)算出大鼠常規(guī)每日灌胃量。陽(yáng)性藥組、滋腎通關(guān)方組及藥對(duì)組大鼠分別灌胃給予左氧氟沙星溶液(21 mg/kg)、滋腎通關(guān)方(2.0 g/kg)及黃柏-知母混懸液(2.0 g/kg)，每日給藥1次，連續(xù)給藥7 d。對(duì)照組、模型組灌胃等體積0.9%氯化鈉溶液。(1)左氧氟沙星溶液：取鹽酸左氧氟沙星片，研末溶解，配成質(zhì)量濃度為4.2 mg/ml的溶液。(2)滋腎通關(guān)方：自制，按滋腎通關(guān)方中知母、黃柏、肉桂比例10∶10∶1稱配，打粉，加0.9%氯化鈉溶液配制成質(zhì)量濃度為1 g/ml飲片量的混懸液，置于4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?，臨用時(shí)混勻。(3)黃柏-知母混懸液：自制，分別取黃柏、知母飲片，按滋腎通關(guān)方比例，稱配，打粉，加0.9%氯化鈉溶液配制成質(zhì)量濃度為1 g/ml飲片量的混懸液，置于4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?，臨用時(shí)混勻。

2.4 檢測(cè)項(xiàng)目

(1)肉眼觀察：肉眼觀察動(dòng)物的生長(zhǎng)情況(包括外觀及活動(dòng)情況)、腎臟大小、表面色澤以及是否平滑。(2)病理學(xué)組織檢查：將腎臟組織固定于10%中性福爾馬林固定液中，制作常規(guī)石蠟切片，采用蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染色、Masson染色，光學(xué)顯微鏡下檢查。研究“黃柏-知母”藥對(duì)、滋腎通關(guān)方及陽(yáng)性藥對(duì)模型大鼠的治療作用。

2.5 血清樣本的收集

動(dòng)物麻醉后取血，血樣以4 000 r/min離心10 min，移取上清血漿，-80 ℃冷凍保存，備用。

2.6 血清指標(biāo)的含量測(cè)定

采用ELISA法，使用大鼠細(xì)胞因子ELISA檢測(cè)試劑盒，根據(jù)操作說(shuō)明書(shū)測(cè)定各組大鼠血清IL-1α、IL-1β、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、IL-6、單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP-1)和CXCL2的含量。

2.7 數(shù)據(jù)分析

3 結(jié)果

3.1 動(dòng)物生長(zhǎng)情況

綜合大鼠生長(zhǎng)情況，總體而言，模型組、藥對(duì)組大鼠精神萎靡，倦臥少動(dòng)，毛發(fā)光澤差、蓬亂；滋腎通關(guān)方組、陽(yáng)性藥組大鼠活動(dòng)良好，毛色光亮、整齊；對(duì)照組大鼠活動(dòng)情況無(wú)明顯改變。

3.2 腎臟組織肉眼觀察

對(duì)照組大鼠腎臟表面光滑，色澤紅潤(rùn)，雙腎大小正常，切面可見(jiàn)腎皮質(zhì)、髓質(zhì)界限清楚。模型組大鼠腎臟充血腫大，表面不光滑，形狀不規(guī)則，雙腎可見(jiàn)多發(fā)融合膿灶突出表面；縱切面可見(jiàn)組織充血潰瘍，膿腫形成，腎盂擴(kuò)張，腎皮質(zhì)、髓質(zhì)界限不清。陽(yáng)性藥組、滋腎通關(guān)方組及藥對(duì)組大鼠腎臟上述癥狀明顯改善，腎臟表面光滑度相較模型組略高；藥對(duì)組膿灶與模型組相比略小，而陽(yáng)性藥組、滋腎通關(guān)方組和模型組相比膿灶無(wú)明顯輪廓，見(jiàn)圖1。

A.對(duì)照組；B.模型組；C.陽(yáng)性藥組；D.滋腎通關(guān)方組；E.藥對(duì)組A. control group; B. model group; C. positive drug group; D. Zishen Tongguan prescription group; E. drug combination group圖1 五組大鼠腎臟外形比較(造模7 d)Fig 1 Comparison of kidney shape of rats among five groups (7 d after modeling)

3.3 組織病理學(xué)檢查

五組大鼠腎臟病理學(xué)變化見(jiàn)圖2—3。由圖可見(jiàn)，對(duì)照組大鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)完整，未見(jiàn)明顯異?；虿±砀淖?；模型組大鼠間質(zhì)下可見(jiàn)到大量淋巴細(xì)胞灶性浸潤(rùn)，間質(zhì)區(qū)毛細(xì)血管擴(kuò)張，腎皮質(zhì)、髓質(zhì)界限模糊充血，腎小球明顯固縮，腎小球囊纖維性肥厚，腎實(shí)質(zhì)萎縮具纖維化，殘留腎小管擴(kuò)張，上皮細(xì)胞萎縮、消失，腔內(nèi)紅染物潴留，似甲狀腺樣結(jié)構(gòu)；陽(yáng)性藥組、藥對(duì)組及滋腎通關(guān)組大鼠上述癥狀明顯改善，腎小球變大，淋巴細(xì)胞減少，且腎皮質(zhì)、髓質(zhì)界限清晰，逐漸向正常好轉(zhuǎn)，其中陽(yáng)性藥組及滋腎通關(guān)方組顯示效果明顯優(yōu)于藥對(duì)組。

A.對(duì)照組；B.模型組；C.陽(yáng)性藥組；D.滋腎通關(guān)方組；E.藥對(duì)組A. control group; B. model group; C. positive drug group; D. Zishen Tongguan prescription group; E. drug combination group圖2 五組大鼠腎臟病理學(xué)變化(HE染色，×200，造模7 d)Fig 2 Renal pathological changes among five groups (HE, ×200, 7 d after modeling)

3.4 含量測(cè)定結(jié)果

五組大鼠血清炎癥因子含量比較見(jiàn)表1、圖4。由圖4結(jié)果可知，模型組大鼠的IL-1α、 IL-1β、TNF-α、IL-6、MCP-1及CXCL2含量均比對(duì)照組高，其中模型組大鼠血清IL-1α、CXCL2含量與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說(shuō)明本次模型制備成功，模型組大鼠體內(nèi)產(chǎn)生明顯的炎癥反應(yīng)。根據(jù)EILSA結(jié)果，陽(yáng)性藥組、藥對(duì)組及滋腎通關(guān)方組大鼠體內(nèi)炎癥因子含量相對(duì)模型組均有降低，證明該三組所用藥物均具有減輕模型動(dòng)物炎癥反應(yīng)的效果。其中，滋腎通關(guān)方組大鼠血清IL-1α、陽(yáng)性藥組大鼠血清TNF-α含量與模型組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 五組大鼠血清炎癥因子含量比較Tab 1 Comparison of serum inflammatory factors among five groups

4 討論

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，腎盂腎炎的大鼠造模有開(kāi)腹結(jié)扎、注射大腸埃希菌于腎皮質(zhì)以及不開(kāi)腹單純膀胱注射3種方式，其中前2種方法都需要開(kāi)腹操作。本研究成功采用不開(kāi)腹的方法建立逆行性急性腎盂腎炎大鼠模型，該模型是尿路感染、腎盂腎炎反復(fù)性發(fā)作的經(jīng)典藥物初篩模型。不開(kāi)腹單純膀胱注射的方法，不結(jié)扎輸尿管，可以減少大鼠創(chuàng)傷與腹腔感染風(fēng)險(xiǎn)，降低大鼠死亡率，同時(shí)簡(jiǎn)化操作過(guò)程、成功率高且不影響機(jī)體免疫功能，且實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦x擇雌性大鼠，更符合急性腎盂腎炎男女患者比例為1∶10的實(shí)際情況[21-23]。

根據(jù)“3.2”“3.3”和“3.4”項(xiàng)的結(jié)果，在對(duì)造模成功大鼠的機(jī)體狀況改善方面，陽(yáng)性藥組、藥對(duì)組及滋腎通關(guān)方組均有改善。通過(guò)比較病理切片可知，滋腎通關(guān)方組與陽(yáng)性藥組明顯優(yōu)于藥對(duì)組，推斷與肉桂在滋腎通關(guān)方中配伍所起作用有關(guān)。

A.對(duì)照組；B.模型組；C.陽(yáng)性藥組；D.滋腎通關(guān)方組；E.藥對(duì)組A. control group; B. model group; C. positive drug group; D. Zishen Tongguan prescription group; E. drug combination group圖3 五組大鼠腎臟病理學(xué)變化(Masson，×200，造模7 d)Fig 3 Renal pathological changes among five groups (Masson, ×200, 7 d after modeling)

A.IL-1α； B.IL-1β； C.TNF-α； D.IL-6； E.MCP-1； F.CXCL2；與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01A.IL-1α； B.IL-1β； C.TNF-α； D.IL-6； E.MCP-1； F.CXCL2； vs. the control group, *P<0.05, **P<0.01; vs. the model group, #P<0.05, ##P<0.01圖4 五組大鼠血清炎癥因子含量比較Fig 4 Comparison of serum inflammatory factors among five groups n=8)

通過(guò)表1、圖4的結(jié)果可知，藥對(duì)組大鼠血清炎癥因子除IL-6含量略低以外，其他5個(gè)指標(biāo)含量與滋腎通關(guān)方組相比雖無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但均高于滋腎通關(guān)方組，說(shuō)明藥對(duì)組對(duì)腎盂腎炎的炎癥的治療作用相比滋腎通關(guān)方組要低。究其原因，可能是滋腎通關(guān)方中肉桂反佐配伍所起的作用能夠促進(jìn)黃柏、知母中活性成分下調(diào)IL-1α、 IL-1β、TNF-α、IL-6、MCP-1及CXCL2等炎癥因子的表達(dá)，影響下游炎癥因子的免疫應(yīng)答，進(jìn)而起到抗炎以及保護(hù)腎臟等泌尿系統(tǒng)器官的雙向調(diào)節(jié)作用。

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中也出現(xiàn)了設(shè)計(jì)不夠合理、不夠完善的問(wèn)題。在檢測(cè)模型是否成功的指標(biāo)中，還可以增加腎重系數(shù)、體重指數(shù)和腎功能的生化指標(biāo)測(cè)定以及細(xì)菌培養(yǎng)(尿液、腎臟組織細(xì)菌培養(yǎng))等項(xiàng)目，為了結(jié)果的準(zhǔn)確性、可靠性，課題組將會(huì)對(duì)以上不足之處進(jìn)行深入研究。

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，不同組大鼠間的藥效學(xué)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異并不太顯著，且同一組內(nèi)指標(biāo)含量差異大，究其原因，可能是由于個(gè)體差異大或者樣本數(shù)量不足造成的。為了結(jié)果的準(zhǔn)確性、可靠性，課題組將會(huì)進(jìn)一步進(jìn)行滋腎通關(guān)方配伍的藥效學(xué)研究。