杜健磊,王俊蘋,劉 偉

1)駐馬店市中心醫(yī)院藥學(xué)部 河南駐馬店 463000 2)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院臨床藥學(xué)室 河南新鄉(xiāng) 453003

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是多種病因引起的急腹癥，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，炎癥介質(zhì)、胰腺腺泡細(xì)胞鈣超載等均與其發(fā)病有關(guān)[1-2]。研究[3]表明中藥治療AP療效確切，可降低病死率。黃酮類化合物主要以游離的苷元或糖結(jié)合的苷類形式存在于植物體內(nèi)，黃酮苷元比結(jié)合型糖苷具有更強(qiáng)的抗炎、抗氧化功能[4]。銀杏黃酮苷元(ginkgo flavone aglycone，GA)是銀杏葉提取物中的黃酮苷通過化學(xué)修飾去除糖基后獲得的新型物質(zhì)，研究[5]認(rèn)為GA對腦缺血和動(dòng)脈粥樣硬化具有較好的防治作用。GA通過NF-κB信號(hào)通路減弱心肌缺血再灌注損傷中的細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)[6]。雙特異性磷酸酶1(dual specificity phosphatase 1，DUSP1)也稱為絲裂素活化蛋白激酶磷酸酶1(mitogen-activated protein kinase phosphatase 1，MKP1)。研究[7]表明沉默DUSP1可通過激活A(yù)P小鼠血清中的絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號(hào)通路來促進(jìn)促炎細(xì)胞因子的釋放[8]。本實(shí)驗(yàn)用雨蛙素刺激大鼠胰腺腺泡AR42J細(xì)胞制備AP腺泡模型細(xì)胞[8]，觀察GA對AP腺泡細(xì)胞炎癥因子分泌和凋亡的影響，探討其機(jī)制是否與DUSP1有關(guān)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞株與主要試劑大鼠胰腺腺泡細(xì)胞株AR42J購自上海圻明生物科技有限公司；胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基購自上海聯(lián)碩生物科技有限公司；雨蛙素購自美國Sigma公司；GA由貴州省生化中心何照范教授惠贈(zèng)；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司；ELISA試劑盒購自上海博湖生物科技有限公司；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自上?？泼羯锟萍加邢薰?；RIPA蛋白裂解液、BCA試劑盒購自蘇州瑞諾德生物科技有限公司；qRT-PCR檢測試劑盒購自北京綠源伯德生物科技有限公司。兔源Bax、Bcl-2和DUSP1抗體為美國Abcam公司產(chǎn)品。

1.2AP腺泡細(xì)胞模型的建立AR42J用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天換液1次，細(xì)胞融合至80%左右進(jìn)行傳代。取對數(shù)生長期細(xì)胞，加入100 nmol/L雨蛙素刺激6 h，細(xì)胞凋亡增加及IL-6、TNF-α水平升高表明AP腺泡細(xì)胞模型成功建立[9]。

1.3細(xì)胞處理與分組①正常培養(yǎng)的AR42J細(xì)胞作為空白對照組，按1.2處理的細(xì)胞為AP組，以用15、30、60 mg/L GA處理48 h的模型細(xì)胞作為GA低、中、高濃度組。②將pcDNA、pcDNA-DUSP1轉(zhuǎn)染至AR42J細(xì)胞6 h后，再用100 nmol/L雨蛙素刺激6 h，分別作為AP+pcDNA組、AP+pcDNA-DUSP1組。③將si-NC、si-DUSP1轉(zhuǎn)染至AR42J細(xì)胞6 h后，再用100 nmol/L雨蛙素和60 mg/L的GA處理48 h，分別作為AP+GA+si-NC組、AP+GA+si-DUSP1組，另取模型細(xì)胞作為AP組，用100 nmol/L雨蛙素和60 mg/L的GA處理48 h的細(xì)胞作為AP+GA組。具體轉(zhuǎn)染方法按LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明操作。

1.4ELISA法檢測IL-6、TNF-α分泌水平細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，取培養(yǎng)上清，采用ELISA試劑盒進(jìn)行IL-6和TNF-α水平檢測。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡情況細(xì)胞分組處理后用預(yù)冷的PBS漂洗2次，先加入10 μL的Annexin V-FITC，再加入5 μL的PI，混勻后避光孵育10 min。用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6Western blot法檢測Bcl-2、Bax、DUSP1蛋白表達(dá)收集各組細(xì)胞，提取總蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量。取50 μg蛋白樣品于100 g/L的SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用50 g/L的牛血清蛋白封閉1 h。加入一抗(均按照1∶1 000稀釋)4 ℃過夜，TBST洗膜3次；加入二抗室溫培養(yǎng)1 h，再用TBST洗滌3次，加入化學(xué)發(fā)光試劑顯影，用Image J軟件分析，用目的蛋白和內(nèi)參GAPDH條帶灰度值的比值作為目的蛋白表達(dá)水平。每個(gè)蛋白樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7qRT-PCR法檢測DUSP1mRNA的表達(dá)提取空白對照組，AP組，GA低、中、高濃度組細(xì)胞總RNA，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照試劑盒使用說明進(jìn)行PCR，以GAPDH為內(nèi)參。DUSP1上游引物序列：5’-CCCTGAGTACTAGCGTCCCT-3’，下游引物序列：5’-GGCCACCCTGATCGTAGAGT-3’；GAPDH上游引物序列：5’-TCCTGTTCGACAGTCAGCCGCA-3’，下游引物序列：5’-ACCAGGCGCCCAATACGAC CA-3’；引物由上海生工生物工程公司合成。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)；60 ℃延長5 min。相對表達(dá)量用2-ΔΔCt法計(jì)算。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 20.0進(jìn)行分析，AP+pcDNA和AP+pcDNA-DUSP1組間各指標(biāo)比較行兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，其他多組間各指標(biāo)比較采用單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.15組AP細(xì)胞上清中IL-6、TNF-α分泌水平結(jié)果見表1。

表1 5組AP細(xì)胞IL-6、TNF-α水平比較(n=3) ng/L

2.25組細(xì)胞的凋亡情況結(jié)果見表2。

2.35組AP細(xì)胞中DUSP1的表達(dá)結(jié)果見表3。

表2 5組細(xì)胞凋亡情況比較(n=3)

表3 5組細(xì)胞中DUSP1表達(dá)的比較(n=3)

2.4AP+pcDNA組和AP+pcDNA-DUSP1組細(xì)胞檢測指標(biāo)比較結(jié)果見表4。與AP+pcDNA組比較，AP+pcDNA-DUSP1組DUSP1蛋白表達(dá)水平升高，上清中IL-6、TNF-α水平降低，細(xì)胞凋亡率升高，Bcl-2表達(dá)水平降低，Bax表達(dá)水平升高。

2.54組AP細(xì)胞檢測指標(biāo)比較結(jié)果見表5。與AP組比較，AP+GA組DUSP1表達(dá)水平升高，IL-6、TNF-α水平降低，細(xì)胞凋亡率升高，Bcl-2表達(dá)水平降低，Bax表達(dá)水平升高；與AP+GA和AP+GA+si-NC組比較，AP+GA+si-DUSP1組DUSP1表達(dá)水平降低，IL-6、TNF-α水平升高，細(xì)胞凋亡率降低，Bcl-2表達(dá)水平升高，Bax表達(dá)水平降低。

表4 AP+pcDNA組和AP+pcDNA-DUSP1組細(xì)胞檢測指標(biāo)比較(n=3)

表5 4組AP腺泡細(xì)胞檢測指標(biāo)比較(n=3)

3 討論

AP根據(jù)嚴(yán)重程度分為輕癥、中癥和重癥。輕癥AP較為常見，且預(yù)后良好；但重癥AP病情多變，致死率高；炎癥因子及細(xì)胞凋亡在其發(fā)生發(fā)展中起重要作用；AP中胰腺損傷主要表現(xiàn)為腺泡細(xì)胞的凋亡和壞死，壞死的細(xì)胞會(huì)釋放大量炎癥因子，AP的嚴(yán)重程度與胰腺腺泡細(xì)胞凋亡呈負(fù)相關(guān)；誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可在一定程度上減輕AP[9-10]。研究[11]表明中藥治療AP臨床療效較好應(yīng)。有研究[12]報(bào)道GA可通過調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3(STAT3) / Janus激酶2(JAK-2)/ sirtuin-1(SIRT-1)減輕缺血性中風(fēng)大鼠的神經(jīng)炎癥和神經(jīng)元損傷。GA可通過減弱體內(nèi)炎癥反應(yīng)、腎損傷以及腎小管凋亡來保護(hù)小鼠免受脂多糖誘導(dǎo)的急性腎臟損傷[13]。本研究結(jié)果顯示，雨蛙素誘導(dǎo)的AR42J細(xì)胞分泌IL-6、TNF-α水平降低，細(xì)胞凋亡率升高，Bcl-2表達(dá)水平降低，Bax表達(dá)水平升高；提示GA可抑制雨蛙素誘導(dǎo)的AR42J細(xì)胞炎癥因子的釋放以及促進(jìn)腺泡細(xì)胞凋亡，表明GA可能減輕AP嚴(yán)重程度。

且本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)雨蛙素處理大鼠胰腺腺泡細(xì)胞AR42J中DUSP1表達(dá)水平降低。說明DUSP1可能參與了AP的進(jìn)展。已有研究[14]報(bào)道沉默DUSP1可促進(jìn)AP小鼠促炎細(xì)胞因子的釋放。且還有研究[15]報(bào)道DUSP1可保護(hù)JAK2V617F驅(qū)動(dòng)的真性紅細(xì)胞增多癥祖細(xì)胞免受炎癥應(yīng)激和DNA損傷。MKP-1可調(diào)節(jié)LPS誘導(dǎo)的促炎性巨噬細(xì)胞活化和炎癥反應(yīng)[16]。DUSP1在心肌缺血再灌注損傷中表達(dá)下調(diào)，上調(diào)其表達(dá)可減輕缺血再灌注誘導(dǎo)的心肌損傷[17]。本研究結(jié)果顯示，過表達(dá)DUSP1可降低雨蛙素誘導(dǎo)的AR42J細(xì)胞炎癥因子水平，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)AP+GA組細(xì)胞中DUSP1表達(dá)水平升高，IL-6、TNF-α水平降低，細(xì)胞凋亡率升高，Bcl-2表達(dá)降低，Bax表達(dá)升高，而干擾DUSP1表達(dá)逆轉(zhuǎn)了GA對雨蛙素誘導(dǎo)的AP腺泡細(xì)胞炎癥因子和凋亡的影響，提示GA對雨蛙素誘導(dǎo)的AP腺泡細(xì)胞炎癥因子和凋亡的影響與DUSP1表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，GA可通過上調(diào)DUSP1表達(dá)抑制雨蛙素誘導(dǎo)的AP腺泡細(xì)胞炎癥反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。