吳冬梅，趙 旭，汪 坤，楊艷華，崔應(yīng)麟

1)河南省中醫(yī)院門診部 鄭州 450002 2)河南省中醫(yī)院藥學(xué)部 鄭州 450002 3)河南省中醫(yī)院腦病科 鄭州 450002

腦出血(intracerebral hemorrhage，ICH)是指非外傷性腦實(shí)質(zhì)內(nèi)的自發(fā)性出血，具有高發(fā)病率、高致死率和高致殘率的特點(diǎn)；ICH會(huì)引起腦血腫、腦水腫、顱內(nèi)壓升高、腦損傷等一系列病理生理過(guò)程，其中腦損傷是引起ICH患者致死和致殘的關(guān)鍵因素[1]，而且腦損傷后會(huì)引起行為學(xué)的改變。目前，ICH后腦損傷的治療措施有低溫保護(hù)、人工冬眠療法，其目的在于降低腦的基礎(chǔ)代謝而延緩病情發(fā)展；常用的治療藥物有腦細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)修復(fù)藥物，包括神經(jīng)節(jié)苷脂、腦蛋白水解物(腦活素)和清除自由基藥物(依達(dá)拉奉)，但以上藥物治療都屬于對(duì)癥治療[2]。中醫(yī)對(duì)ICH的病機(jī)、治法治則、用藥已經(jīng)形成了成熟的體系[3]。有臨床研究[4]提示，中藥治療ICH具有整體治療、副作用小等優(yōu)勢(shì)。因此尋求中醫(yī)藥治療ICH后繼發(fā)性腦損傷，對(duì)降低ICH致殘率、致死率具有重要意義。

有文獻(xiàn)[5-6]報(bào)道，含大黃的方劑大承氣湯和大黃素對(duì)腦出血大鼠均具有一定的腦保護(hù)作用。課題組的前期研究[7]也發(fā)現(xiàn)以大黃為君藥的醒腦灌腸液對(duì)ICH模型大鼠具有顯著的腦保護(hù)作用，說(shuō)明大黃在ICH治療中具有重要的應(yīng)用價(jià)值，但其作用機(jī)制尚不清楚。為此，課題組開(kāi)展了如下研究，探討大黃對(duì)ICH模型大鼠的腦保護(hù)作用及機(jī)制，為大黃在ICH的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要儀器雄性Wistar大鼠，共200只，體重250～300 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，合格證號(hào)SCXK(京)2016-0011。ZH-藍(lán)星D型動(dòng)物腦立體定位儀(安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司)，CPA324S型電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)，生物顯微鏡(日本奧林巴斯公司)，全自動(dòng)酶標(biāo)儀[賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司]。DYCZ-24DN垂直電泳槽、DYY-7C電泳儀電源、DYCZ-40電轉(zhuǎn)儀(北京六一儀器廠)，磁力攪拌器(江蘇金壇市中大儀器廠)，HI650離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司)。

1.2主要試劑和藥物Ⅶ型膠原酶(美國(guó)Sigma公司)，水合氯醛、多聚甲醛(北京索萊寶科技有限公司)、羧甲基纖維素鈉(CMC-Na，天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司)，依文思藍(lán)(Evans blue，EB；北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司)，RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，谷胱甘肽(GSH)測(cè)試試劑盒(南京建成生物工程研究所)。兔抗人Nrf2抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司公司)，TNF-α、IL-6、IL-4、IL-10和IFN-γ ELISA檢測(cè)試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技有限公司)。

大黃購(gòu)自安徽普仁中藥飲片有限公司(批號(hào)1808043)，經(jīng)河南省中醫(yī)院黃小敏副主任藥師鑒定為蓼科植物藥用大黃的干燥根及根莖。大黃提取液的制備：體積分?jǐn)?shù)75%乙醇回流提取2次(100 mL，80 mL)，每次1 h，合并提取液，過(guò)濾，濃縮至質(zhì)量濃度為0.9 g/mL。陽(yáng)性對(duì)照藥安宮牛黃丸(北京同仁堂科技發(fā)展有限公司制藥廠，批號(hào)16011928)，去除球殼，用5 g/L CMC-Na配制成含藥0.18 g/mL的混懸液。

1.3ICH大鼠模型的制備參考文獻(xiàn)[5]方法采用膠原酶注射尾狀核法復(fù)制大鼠腦出血模型，Longa5級(jí)評(píng)分法評(píng)價(jià)模型是否成功。

1.4分組及給藥實(shí)驗(yàn)分組為空白組、假手術(shù)組、ICH模型組、安宮牛黃丸組、大黃組，每組20只(200只大鼠分兩批進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每批100只)。大鼠禁食24 h(避免大鼠頻繁排便，影響灌腸給藥)，不禁水，清醒狀態(tài)下不固定(毛巾蓋住頭部使其保持安靜)進(jìn)行灌腸給藥；將導(dǎo)尿管插入大鼠直腸，深度不超過(guò)4 cm，后端連接注射器吸取藥物并1 mL/min推注水浴加溫至30 ℃的藥液。

空白組(不造模，生理鹽水灌腸)、假手術(shù)組(按照ICH造模方法操作但不注射膠原酶，生理鹽水灌腸)、ICH模型組(造模，生理鹽水灌腸)、安宮牛黃丸組(造模，灌腸給藥安宮牛黃丸混懸液0.27 g/kg)、大黃組(造模，灌腸給藥大黃提取液3.60 g/kg)5個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每組設(shè)4個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)或取樣(每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)均為5只大鼠)，各組動(dòng)物灌腸1次/d。第一次灌腸后于12 h、24 h進(jìn)行實(shí)驗(yàn)或取樣，為12 h、24 h兩個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)；剩余大鼠繼續(xù)給藥2 d后、6 d后實(shí)驗(yàn)或取樣，為3 d、7 d兩個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)。

1.5EB法檢測(cè)ICH大鼠血腦屏障的通透性參考文獻(xiàn)[7]方法，按照1.4項(xiàng)的操作方法，分別于給藥后12 h、24 h、3 d、7 d 4個(gè)時(shí)間點(diǎn)腹腔注射體積分?jǐn)?shù)10%的水合氯醛(3 mL/kg)麻醉大鼠(第一批大鼠)并固定，然后按照4 mL/kg的劑量左側(cè)頸靜脈注射20 g/L EB，大鼠全身變藍(lán)后剖開(kāi)胸腔，用注射針頭從左心尖插入肺動(dòng)脈，固定針頭后剪開(kāi)右心耳，生理鹽水沖洗右心耳直至流出液清澈，在冰盤上迅速斷頭取腦并自正中線切開(kāi)，用濾紙吸干出血側(cè)腦組織表面的水分，稱腦組織的重量。腦組織放置于5倍體積的甲酰胺中，60 ℃水浴放置24 h，3 000 r/min離心10 min，取上清液，用分光光度計(jì)在620 nm處測(cè)定吸光度(以甲酰胺標(biāo)準(zhǔn)液做空白對(duì)照并做標(biāo)準(zhǔn)曲線)，計(jì)算腦組織中EB含量(腦組織EB含量=樣品EB濃度/腦濕重)。

1.6大鼠腦功能損傷程度評(píng)分采用改良的神經(jīng)功能損傷程度評(píng)分(modified neurological severity score，mNSS)對(duì)各組大鼠(第二批大鼠)腦損傷程度進(jìn)行評(píng)價(jià)[6]。按照1.4項(xiàng)的操作方法，分別于給藥后12 h、24 h、3 d、7 d 4個(gè)時(shí)間點(diǎn)記錄每只大鼠的mNSS得分，分析每組大鼠神經(jīng)功能損傷及恢復(fù)情況。

1.7大鼠血清中TNF-α、IL-6、IFN-γ、IL-4、IL-10、GSH含量的ELISA 法檢測(cè)按照1.4項(xiàng)的操作方法，分別于給藥后12 h、24 h、3 d、7 d后4個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組各取5只大鼠(第二批大鼠)，腹主動(dòng)脈取血，離心后取上層血清，采用ELISA法檢測(cè)大鼠血清中GSH、TNF-α、IL-6、IL-4、IL-10和IFN-γ含量，具體步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.8大鼠腦組織中Nrf2蛋白表達(dá)的Western blot檢測(cè)1.7項(xiàng)中的大鼠采血后迅速斷頭處死，開(kāi)顱并剝離、保留出血側(cè)腦組織，PBS沖洗干凈后進(jìn)行總蛋白提取、濃度測(cè)定。取每個(gè)樣品的總蛋白40 μg加入電泳槽的上樣孔，進(jìn)行電泳分離；將樣品凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜(轉(zhuǎn)膜條件為GAPDH：200 mA 90 min；Nrf2：200 mA 120 min后300 mA 30 min)；轉(zhuǎn)膜后室溫封閉2 h；加入一抗(GAPDH按1∶1 000稀釋；Nrf2按1∶600稀釋)4 ℃孵育過(guò)夜；封閉液洗滌PVDF膜6次，5 min/次；加入二抗(按1∶50 000稀釋)37 ℃搖床孵育2 h，封閉液洗滌PVDF膜6次，5 min/次。滴加ECL進(jìn)行顯色，反應(yīng)至熒光帶明顯后，吸去多余液體，覆上保鮮膜，X光膠片壓片后依次顯影、定影、沖洗膠片。晾干后掃描膠片，用BandScan 5.0軟件分析膠片灰度值。以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH條帶灰度值的比值表示Nrf2蛋白的表示相對(duì)表達(dá)量。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 25.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，應(yīng)用單因素方差分析比較各組大鼠及其不同時(shí)間點(diǎn)腦組織中EB含量，mNSS評(píng)分，血清中TNF-α、IL-6、IFN-γ、IL-4、IL-10、GSH含量以及出血側(cè)腦組織中Nrf2蛋白相對(duì)表達(dá)量的差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血腦屏障的通透性的變化見(jiàn)表1。由表1可知，ICH模型組與假手術(shù)組比較，EB含量升高(P<0.05)，說(shuō)明ICH模型組大鼠血腦屏障通透性增加，3 d時(shí)達(dá)到峰值。與ICH組比較，安宮牛黃丸組大鼠腦組織EB含量降低(P<0.05)，大黃組在12 h、3 d時(shí)大鼠腦組織EB含量降低(P<0.05)。

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)腦組織中EB含量比較(n=5)

2.2各組大鼠mNSS評(píng)分的比較空白組4個(gè)時(shí)間點(diǎn)mNSS評(píng)分均為0；假手術(shù)組12和24 h mNSS評(píng)分均為(2.24±0.39)，3和7 d時(shí)mNSS評(píng)分均為0。其余3組mNSS評(píng)分見(jiàn)表2。由表2可知，ICH模型組mNSS評(píng)分升高，說(shuō)明出血模型造模成功；且隨著出血的發(fā)展，mNSS評(píng)分升高，3 d時(shí)達(dá)到峰值。與ICH模型組比較，安宮牛黃丸組在4個(gè)時(shí)間點(diǎn)時(shí)大鼠的mNSS評(píng)分均降低(P<0.05)，大黃組在3 d、7 d時(shí)大鼠的mNSS評(píng)分降低(P<0.05)。

表2 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)mNSS評(píng)分比較(n=5)

2.3各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清中TNF-α含量的比較見(jiàn)表3。由表3可知，與假手術(shù)組比較，ICH模型組大鼠4個(gè)時(shí)間點(diǎn)血清中TNF-α的含量均增加(P<0.05)。與ICH模型組比較，安宮牛黃丸組大鼠4個(gè)時(shí)間點(diǎn)血清中TNF-α的含量降低(P<0.05)；大黃組在24 h、3 d、7 d時(shí)TNF-α的含量降低(P<0.05)。

2.4各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清中IL-6含量的比較見(jiàn)表4。由表4可知，與假手術(shù)組比較，ICH模型組大鼠4個(gè)時(shí)間點(diǎn)血清中IL-6的含量升高(P<0.05)。與ICH模型組比較，安宮牛黃丸組和大黃組大鼠4個(gè)時(shí)間點(diǎn)血清中IL-6的含量均降低(P<0.05)。

表3 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清中TNF-α含量的比較(n=5) ng/L

表4 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清中IL-6含量的比較(n=5) ng/L

2.5各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清中IFN-γ含量的比較見(jiàn)表5。由表5可知，空白組與假手術(shù)組比較，ICH模型組大鼠4個(gè)時(shí)間點(diǎn)血清中IFN-γ的含量增加(P<0.05)。與ICH模型組比較，安宮牛黃丸組和大黃組大鼠4個(gè)時(shí)間點(diǎn)血清中IFN-γ的含量均降低(P<0.05)。

表5 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清中IFN-γ含量的比較(n=5) ng/L

2.6各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清中IL-4含量的比較見(jiàn)表6。由表6可知，與假手術(shù)組比較，ICH模型組大鼠血清中IL-4的含量在出血后12 h升高(P<0.05)，然后隨著出血的進(jìn)展，在24 h、3 d、7 d時(shí)IL-4的含量降低(P<0.05)。與ICH模型組比較，安宮牛黃丸組大鼠4個(gè)時(shí)間點(diǎn)血清中IL-4含量均升高(P<0.05)；大黃組IL-4含量在3 d、7 d時(shí)升高(P<0.05)。

表6 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清中IL-4含量的比較(n=5) ng/L

2.7各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清中IL-10含量的比較見(jiàn)表7。由表7可知，與假手術(shù)組比較，ICH模型組大鼠血清中IL-10的含量在出血后12 h是先升高，然后隨著出血的進(jìn)展，在24 h、3 d、7 d時(shí)IL-10的含量降低(P<0.05)。與ICH模型組比較，安宮牛黃丸組和大黃組大鼠血清中IL-10的含量在24 h、3 d和7 d時(shí)升高(P<0.05)。

表7 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清中IL-10含量的比較(n=5) ng/L

2.8各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清中GSH含量的比較見(jiàn)表8。由表8可知，與空白組相比，假手術(shù)組GSH含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與假手術(shù)組比較，ICH模型組大鼠4個(gè)時(shí)間點(diǎn)血清中GSH的含量降低(P<0.05)，說(shuō)明ICH過(guò)程中生成大量ROS，它能夠消耗GSH并使其水平降低。與ICH組比較，安宮牛黃丸組大鼠4個(gè)時(shí)間點(diǎn)血清中GSH的含量增加(P<0.05)；大黃組大鼠血清中GSH的含量在24 h、3 d、7 d時(shí)增加(P<0.05)。

表8 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清中GSH含量的比較(n=5) μmol/L

2.9各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)出血側(cè)腦組織中Nrf2蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較見(jiàn)表9。由表9可知，與空白組相比，假手術(shù)組出血側(cè)腦組織中Nrf2蛋白的相對(duì)表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與假手術(shù)組比較，在12 h、24 h、3 d、7 d時(shí)ICH模型大鼠出血側(cè)腦組織中Nrf2蛋白的相對(duì)表達(dá)量升高(P<0.05)。與ICH組比較，安宮牛黃丸組出血側(cè)腦組織中Nrf2蛋白的相對(duì)表達(dá)量升高(P<0.05)；大黃組大鼠出血側(cè)腦組織中Nrf2蛋白的相對(duì)表達(dá)量在3、7 d時(shí)升高(P<0.05)。

表9 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)出血側(cè)腦組織中Nrf2蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較(n=5)

3 討論

現(xiàn)代藥理研究[8]表明，安宮牛黃丸可以通過(guò)抗氧化、抗炎等作用改善患者認(rèn)知功能和神經(jīng)功能，因此本研究中選擇安宮牛黃丸為陽(yáng)性對(duì)照藥物。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示安宮牛黃丸在大鼠ICH中表現(xiàn)出明確的抗氧化、抗炎效應(yīng)，指標(biāo)顯現(xiàn)相應(yīng)的改變。大黃是我國(guó)常用中藥之一，具有清熱攻積、瀉火涼血、逐瘀解毒之功效，其主要活性成分為蒽醌類化合物，主要為大黃酚、大黃素、大黃素甲醚、蘆薈大黃素、大黃酸等。近年來(lái)，大黃及其活性成分對(duì)腦損傷的抗炎和抗氧化的作用研究越來(lái)越多：彭紹鵬等[9]采用自體血注入大鼠紋狀體建立腦出血模型，以大黃素干預(yù)，發(fā)現(xiàn)大黃素治療組能夠降低TNF-α的含量，抑制炎性因子的釋放，降低谷氨酸的表達(dá)水平，減輕腦出血后腦水；趙薇等[10]研究大黃酚對(duì)于腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)方面的保護(hù)作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，大黃酚可以上調(diào)SIRT3的表達(dá)，增強(qiáng)SOD的抗氧化作用，增強(qiáng)抗細(xì)胞凋亡作用，下調(diào)AQP4的表達(dá)，進(jìn)而減輕腦缺血后腦水腫的發(fā)生，發(fā)揮其對(duì)腦缺血再灌注的神經(jīng)保護(hù)作用；畢勇志等[11]研究表明，大黃素可通過(guò)抑制 NF-κB信號(hào)通路，降低大鼠海馬組織中促炎性細(xì)胞因子如 IL-6、IL-1β和 TNF-α的水平，抑制腦組織的炎癥反應(yīng)，發(fā)揮對(duì)局灶性腦缺血的神經(jīng)保護(hù)作用。

血腦屏障(blood-brain barrier，BBB)是保持腦組織生理環(huán)境的重要屏障，可以有效避免腦組織被循環(huán)血液中的有害物質(zhì)損害，對(duì)保持中樞神經(jīng)系統(tǒng)的有效生理功能具有重要意義[12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大黃提取液干預(yù)ICH模型大鼠后，在3 d作用時(shí)間點(diǎn)可以有效降低血腦屏障通透性、改善mNSS評(píng)分，發(fā)揮了腦保護(hù)作用。

TNF-α、IL-6、IFN-γ均是腦出血后高表達(dá)的炎癥細(xì)胞因子，這些炎癥細(xì)胞因子在后續(xù)的繼發(fā)性腦損傷中發(fā)揮著重要角色，通過(guò)炎性浸潤(rùn)激發(fā)基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)，破壞血腦屏障，進(jìn)而引起神經(jīng)細(xì)胞凋亡[13-14]；抗炎細(xì)胞因子IL-4可以抑制TNF-α、IL-6的表達(dá)[15]；IL-10能降低炎癥應(yīng)激反應(yīng)[16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大黃提取液干預(yù)ICH模型大鼠后，可以顯著上調(diào)IL-4、IL-10表達(dá)，下調(diào)TNF-α、IL-6、IFN-γ 表達(dá)，發(fā)揮抗炎作用。

ICH病理過(guò)程中發(fā)生的氧化應(yīng)激反應(yīng)是導(dǎo)致BBB破壞的重要機(jī)制[17]。氧化應(yīng)激損傷與體內(nèi)清除自由基的天然抗氧化物如GSH的消耗有關(guān)。ICH過(guò)程中生成的大量ROS能夠消耗GSH，使其水平降低，進(jìn)一步削弱血腫組織的抗氧化能力。Nrf2是維護(hù)機(jī)體抗氧化與氧化平衡的重要因子，在受到氧化應(yīng)激等刺激后激活，轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核內(nèi)，以Nrf2-Maf 的形式與ARE結(jié)合，通過(guò)相關(guān)激活程序，促使下游基因轉(zhuǎn)錄，常見(jiàn)的下游基因產(chǎn)物多是抗氧化物質(zhì)，包括醌氧化還原酶、谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶、谷氨酰半胱氨酸連接酶以及血紅素加氧酶1等，可有效對(duì)抗腦出血后的腦損傷[18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大黃提取液干預(yù)ICH模型大鼠后，可以上調(diào)ICH模型大鼠腦組織中Nrf2蛋白的相對(duì)表達(dá)量、增加血清中GSH含量，發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用，減輕腦損傷。

總之，本研究結(jié)果顯示大黃可通過(guò)抗炎和抗氧化作用，起到保護(hù)血腦屏障的作用，從而發(fā)揮對(duì)ICH的腦保護(hù)作用。