李 武，李光玉，肖穎妮，胡建廣，李春艷，李余良，盧文佳，李高科，劉建華

（廣東省農業(yè)科學院作物研究所/廣東省農作物遺傳改良重點實驗室，廣東 廣州 510640）

【研究意義】甜玉米是一類果蔬兼用的特用型玉米，其形成是由于淀粉合成代謝途徑發(fā)生基因突變，導致淀粉合成途徑受阻、蔗糖等糖類物質積累。由于甜玉米是普通玉米籽粒淀粉合成基因突變產生，其種子活力普遍較低，這成為制約我國甜玉米生產的主要因素之一。低溫發(fā)芽率是甜玉米種子活力鑒定的重要指標，但目前有關玉米應對低溫脅迫的研究尚不充分［1］。低溫脅迫主要分為冷害脅迫（＜15 ℃）和凍害脅迫（＜0 ℃）。作為C4 植物代表的玉米，當溫度低于15 ℃或者更低時，容易遭受冷害脅迫而影響發(fā)芽率［2］。伴隨全球氣候變化，極端天氣頻發(fā)，廣東近5 年來的春季最低氣溫維持在4～5 ℃左右，平均氣溫約13 ℃，玉米直播常遭遇低溫脅迫，不耐低溫發(fā)芽的品種往往容易受災。因此，低溫發(fā)芽特性好的甜玉米品種對推廣直播栽培、實現(xiàn)節(jié)本增效具有重要價值［3］。挖掘鑒定低溫發(fā)芽相關調控基因，將為闡明甜玉米低溫發(fā)芽的生物學基礎、加快育種改良提供重要的理論支撐。

【前人研究進展】玉米耐冷性遺傳研究與功能鑒定主要集中在發(fā)芽期和苗期。早期研究中，Mc Connell 等［4］研究6 個耐冷性差異顯著的自交系及其F1、F2和回交群體，發(fā)現(xiàn)苗期活力受加性和顯性效應控制，而發(fā)芽能力受加性、顯性效應和上位性基因調控。Hodges 等［5］研究由4 個耐冷能力不同的自交系完全雙列雜交得到的群體，結果表明不同群體在發(fā)芽期和苗期耐冷性的遺傳因素可能不同。Revilla 等［6］利用同樣的方法研究5個自交系及其后代F1的耐冷性，發(fā)現(xiàn)高發(fā)芽率和苗期快速生長兩個耐冷性狀的遺傳調控符合加－顯性模型。近年來，較多學者利用不同的作圖群體對玉米耐低溫發(fā)芽和苗期耐冷的數量性狀遺傳位點（Quantitative trait locus，QTL）進行鑒定。例如，利用不同作圖群體（F2:4家系、重組自交系群體等）研究玉米耐冷相關QTL，多集中于分析發(fā)芽期發(fā)芽和苗期光合作用性狀，如發(fā)芽指數、光合作用效率、根干重、莖含氮量等指標［7］。有學者利用ETH-DH7×ETH-DL3 構建的F2:3群體，于第6號染色體定位到低溫下控制苗期光合作用的主效QTL，且該位點能在多個環(huán)境下被重復檢測［8］。隨后Nguyen 等［9］利用相同的F2:3群體研究低溫下苗期光合系統(tǒng)耐冷性，但檢測到的主效QTL 位于第3 號染色體上。Rodriguez［10］利用210 份F2:3家系（EP42×A661），以莖干重、存活率等為評價指標，在低溫環(huán)境下檢測到4 個QTL（其中1個為存活率QTL）。Hu 等［11］利用重組自交系群體，以相對出芽率、初生根長為指標，通過不同溫度時間處理（12 ℃16 h、18 ℃8 h、28 ℃24 h）鑒定出15 個QTL，主要分布在第4、5、6、7、9號染色體上。李旭輝等［12］利用低溫萌發(fā)能力高的玉米自交系220 和P9-10，以及低溫出苗能力弱的自交系Y1518 和PH4CV，配制了3 個F2:3群體，通過6K 玉米SNP 芯片做基因型鑒定，確定了67 個與低溫發(fā)芽相關的QTL，其中17 個貢獻率大于10%。上述研究報道，均以普通玉米種子為分析對象，鮮有甜玉米種子低溫萌發(fā)相關的分子遺傳學研究。

【本研究切入點】 根據前期工作對甜玉米種子低溫下的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數、活力指數等指標的綜合評價，我們獲得了2 份低溫萌發(fā)能力差異顯著的甜玉米自交系Scil-H7th 和Scil-C4th。【擬解決的關鍵問題】利用低溫萌發(fā)能力高的Scil-H7th 為供體親本（DP）、低溫萌發(fā)能力低的Scil-C4th 為輪回親本（RP），雜交構建近等基因系（Near Iso-genic Lines,NIL），并分析不同品系的低溫萌發(fā)能力。通過轉錄組測序分析低溫萌發(fā)能力不同的材料，以鑒定甜玉米耐低溫萌發(fā)的相關基因，為后續(xù)甜玉米耐低溫萌發(fā)特異種質資源的創(chuàng)制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

甜玉米自交系Scil-C4th（輪回親本，RP）和Scil-H7th（供體親本，DP）于2014 年早季在廣東省農業(yè)科學院白云試驗基地種植并雜交獲得F1；以Scil-C4th 為輪回親本連續(xù)回交4 次，經過4 代自交得到穩(wěn)定自交系，并通過種子標準發(fā)芽試驗進行表型選擇，最終獲得3 個RP 背景的NIL品系，分別命名為L6、L18 及L41。篩選完整飽滿的Scil-C4th、Scil-H7th 及NIL 品系甜玉米種子作為本試驗材料。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子發(fā)芽處理 將Scil-C4th、Scil-H7th 及NIL 不同品系甜玉米種子浸泡12 h 后進行種子發(fā)芽試驗，分別在15 ℃人工氣候箱中培養(yǎng)，每個發(fā)芽處理3 次重復，每個重復100 粒種子。樣品在12 h 光照/12 h 黑暗環(huán)境中生長，光照強度為250 μmol/m2·s，持續(xù)7 d［13］。在吸脹后1 d（時期Ⅰ）和吸脹后3 d（時期Ⅱ），從樣本中隨機收集5 個種子胚，液氮凍存，用于提取RNA 進行高通量測序。發(fā)芽試驗期間，每天計數發(fā)芽種子，并在吸脹后7 d 測量根長、莖高以及計算發(fā)芽率［14］，在80 ℃干燥24 h 后測定幼苗干重。計算發(fā)芽指數（GI）和種子活力指數（VI）：

式中，Gt為第t天發(fā)芽種子的數量，Tt為對應于Gt的時間（d），W為幼苗干重。

1.2.2 RNA 提取、文庫制備及測序 將種子胚用液氮勻漿，用植物核糖核酸提取試劑盒（中國天根生物技術有限公司，北京）提取總RNA。通過在1%瓊脂糖凝膠上電泳分析RNA 質量，并用NanoDrop 2000（賽默菲舍科學公司，美國）鑒定RNA 的純度和濃度［15］。隨后，每個樣品取1.5 μg總RNA，按照HiSeq 2500 測序儀（Illumina 公司,美國）說明書進行cDNA 文庫構建、質量控制和高通量測序。

1.2.3 數據拼裝、功能注釋與分類 對測序產生的原始數據進行過濾，刪除包含poly-N 和低質量的reads，以獲得干凈的reads。然后使用bowtie2［16］或Tophat［17］將干凈的reads 比對到參考基因組。每個基因的FPKM 值使用Cufflinks 計算［16］，每個基因的reads 數通過HTseq-coun 計算［18］。P＜0.05 被設置為顯著差異表達的閾值。對篩選出來的差異表達基因（Differentially expressed genes,DEGs）進行基于R 軟件包的GO 富集和KEGG 通路富集分析。

1.2.4 qRT-PCR 驗證候選基因表達量 采用qRT-PCR 技術從轉錄組DEGs 中選擇7 個候選基因表達量進行驗證［15］?；蛐蛄行畔腅nsembl Plants（http://plants.ensembl.org）獲得，引物采用Primer3 設計（https://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/）。使用cDNA 第一條鏈反轉錄超級試劑盒反轉錄獲得樣本的第一鏈cDNA，并根據AceQ qPCR 混合試劑盒操作說明對反轉錄獲得的cDNA 進行qRTPCR驗證。本試驗采用Step-One-Plus系統(tǒng)（Applied Biosystems 公司，美國）進行測定，每個基因采用3 個生物學重復和3 個技術重復測定表達水平［15］。Actin基因被用作獲得Ct 值標準化的內源性參照基因，通過比較Ct（ΔΔCt）方法計算基因的相對表達值。

2 結果與分析

2.1 甜玉米品系DP、RP 及3 個NIL 的發(fā)芽性能

為明確不同品系的低溫萌發(fā)能力，測定自交系Scil-H7th、Scil-C4th 及3 個NIL 的發(fā)芽相關指標。由圖1 可知，DP（Scil-H7th）的種子發(fā)芽和成苗顯著快于RP（Scil-C4th）；而衍生自DP 和RP 的NIL 中，L18 表現(xiàn)出與DP 相似的成苗特性（圖1A）。相比隨機選擇的另外兩個NIL（L41和L6），L18 表現(xiàn)出種子發(fā)芽快和種子活力高的特點；相比親本，L18 在發(fā)芽7 d 后發(fā)芽率達到64.54%，顯著高于RP 的23.58%，其發(fā)芽勢為RP 的1.20 倍，接近DP（圖1B）。由以上指標分析可知，L18 的發(fā)芽指數和種子活力指數均優(yōu)于RP。

2.2 甜玉米品系DP、RP 和L18 的RNA 測序文庫構建、轉錄組測序及聚類分析

圖1 甜玉米品系DP、RP 及3 個NIL 在低溫下的萌發(fā)特性Fig.1 Germination characteristics of sweet corn lines DP,RP and three NILs at low temperature

為了篩選與甜玉米低溫萌發(fā)的相關基因，利用高通量測序對NIL L18 及其親本進行轉錄組分析。RP、DP 和L18 種子經低溫催芽，在吸脹后1 d（時期Ⅰ，以-1 表示）和吸脹后3 d（時期Ⅱ，以-2 表示）取樣，得到RP-1、DP-1、L18-1 和RP-2、DP-2、L18-2 樣品，提取RNA 進行轉錄組測序，每個時期3 次重復，共測序獲得18 個玉米樣品平均8.54 Gb 的原始堿基，經質量控制過濾后的干凈堿基平均為8.14 Gb，Q30 值介于91.71%～92.44%之間。

測序原始數據過濾后，總共51809565～55432742 個reads 用于比對分析。結果（表1）顯示，能夠比對到參考基因組的reads 比例在72.92%～74.84%之間。對于RP、DP 和L18，具有唯一匹配的reads 比例分別為70.57%、70.45%和70.46%。利用FPKM 值（每百萬份映射讀數轉錄本的每千堿基片段）進行定量分析，基因表達量分布如圖2A 所示，結果表明各樣品的基因表達水平分布范圍較為一致；基于相似性和主成分分析對每個樣本進行區(qū)分和聚類，結果（圖2 B和圖2 C）表明重復樣品間相似度高，重復性好。

表1 甜玉米品系DP、RP 和L18 的轉錄組測序數據Table 1 Transcriptome sequencing data of sweet corn lines of DP,RP and L18

2.3 甜玉米品系DP、RP 和L18 在不同萌發(fā)階段的差異表達基因

為了篩選與低溫萌發(fā)相關的基因，對DP、RP 和L18 在不同萌發(fā)時期以及同一萌發(fā)時期3 個品系之間進行比較分析。自交系內不同萌發(fā)時期的分析結果（圖3A）表明，DP-2 和DP-1 共有1629 個DEGs，其中780 個基因表達上調，849個基因表達下調；RP-2 和RP-1 共有2834 個DEGs，其中731 個基因上調表達，2103 個基因表達下調；L18-2 和L18-1 共有1823 個DEGs，其中1002 個基因表達上調，821 個基因表達下調；3 個材料在兩個萌發(fā)時期共有的DEGs 為447 個，其中RP 和L18 共有的DEGs 有986 個，高于L18與DP 之間共有的DEGs（630 個）。分析DP 和RP、L18 與RP 之間相同萌發(fā)時期的DEGs，結果（圖3 B）發(fā)現(xiàn)，DP 與RP 在兩個萌發(fā)時期共有的DEGs 達到了3484 個，而L18 與RP 共有的DEGs 只有627 個，說明L18 遺傳背景已與RP 較接近；取兩者共有基因的交集，獲得410 個共有DEGs，推定為低溫萌發(fā)過程中不同材料間表達差異的基因集。

2.4 功能注釋、通路富集和低溫萌發(fā)相關基因篩選

圖2 RNA 測序分析得到甜玉米品系DP、RP 和L18 的基因表達概況和聚類分析結果Fig.2 Overview of gene expression of sweet corn lines of DP,RP and L18 and clustering analysis result base on RNA sequencing

圖3 甜玉米品系DP、RP 和L18 在低溫萌發(fā)過程中的DEGs 韋維恩圖Fig.3 Venn diagram of DEGs in sweet corn of DP,RP and L18 during low-temperature germination

為了進一步分析DEGs 所在的通路，采用KEEG 數據庫對上述DEGs 進行功能注釋和通路富集分析。結果顯示，共有89 個和43 個涉及的通路被注釋在RP-1 與L18-1 組和RP-2 與L18-2組；在3 個品系中同時鑒定了6 個關鍵通路，包括zma04712 晝夜節(jié)律-植物、zma01040 不飽和脂肪酸生物合成、zma00945 芪類化合物、二芳基庚酸和姜酚生物合成、zma00941 類黃酮生物合成、zma00940苯丙酸生物合成和zma00195光合作用。4個比較組（RP-1 vs DP-1、RP-2 vs DP-2、RP-1 vs L18-1、RP-2 vs L18-2）共有的410個DEGs已完成功能注釋，其中286個基因被鑒定為功能性蛋白質，124個基因為未鑒定蛋白。Zm00001d005672、Zm00001d015497（線粒體烏頭酸水合酶3）、Zm00001d033044（GDSL酯酶/脂肪酶）、Zm00001d033307（肌動蛋白輕鏈1）、Zm00001d033909、Zm00001d033948（Tubbylike F-box蛋白2）和Zm00001d037001（無靜脈樣蛋白）顯示具有超過100倍的上調表達，Zm00001d029587（鋅指蛋白AZF2）是L18中發(fā)現(xiàn)的下調超過100倍的蛋白。進一步分析發(fā)現(xiàn)，65個DEGs僅在DP和L18中表達，而不在RP中表達，其中32個基因在數據庫中被注釋。結合自交系在不同萌發(fā)時期的DEGs和自交系間相同萌發(fā)時期的DEGs，篩選出有交集的20個DEGs（表2），推測這些基因與低溫萌發(fā)密切相關。

表2 20 個與甜玉米低溫萌發(fā)密切相關的DEGs 及功能注釋Table 2 Annotation of 20 DEGs highly related to low-temperature germination of sweet corn

根據注釋信息進行分析，進一步篩選出最有可能參與低溫萌發(fā)過程的7 個上調基因（Zm00001d011006、Zm00001d018738、Z m 00001 d 028815、Z m 00001 d 020652、Z m 00001 d 037383、Z m 00001 d 029696、Zm00001d018195），利用qRT-PCR 對DP 在低溫萌發(fā)過程2 個時期的胚部、根系和嫩葉進行表達水平檢測。結果表明，這些基因表達量變化趨勢與轉錄組測序結果中的變化趨勢趨于一致（圖4 A）。其中，Zm00001d037383（UGT1基因）隨發(fā)芽進程表達顯著上調，并且在胚部的表達顯著高于在其他組織的表達（圖4 B）。

圖4 甜玉米品系DP、RP 和L18 低溫萌發(fā)相關基因的qRT-PCR 分析Fig.4 qRT-PCR analysis of genes related to low-temperature germination of sweet corn lines of DP,RP and L18

3 討論

已有不少報道指出，通過構建近等基因系研究玉米生長發(fā)育和生理過程的潛在分子機制［19-20］。本研究通過將高種子活力甜玉米材料Scil-H7 的染色體片段導入低種子活力材料Scil-C4th 的遺傳背景，獲得了不同種子活力的近等基因系。其中，L18 的種子發(fā)芽率比RP 高23.58%，發(fā)芽勢是RP 的1.20 倍，顯著提高發(fā)芽指數和種子活力指數。生理實驗結果表明，L18很可能攜帶了有利于低溫條件下種子活力和發(fā)芽能力的關鍵基因位點，這為玉米低溫萌發(fā)相關基礎研究提供了有價值的種質資源。

通過Illumina 測序獲得Scil-H7、Scil-C4th和L18 甜玉米胚在兩個發(fā)芽階段平均產生的8.54 Gb 原始序列數據。甜玉米種子發(fā)芽期間已建成了復雜的信號和代謝途徑［21-22］，影響種子發(fā)芽的因素包括不同途徑的變化［23］。轉錄組分析表明，發(fā)芽過程中全基因組基因表達發(fā)生廣泛的變化［24］。許多已鑒定的DEGs 編碼蛋白質在代謝過程和核苷酸/蛋白質結合中的功能已經得到證明。KEGG 富集顯示，本研究在3 個品系中同時鑒定了6 個關鍵通路，包括zma04712 晝夜節(jié)律-植物、zma01040 不飽和脂肪酸生物合成、zma00945 芪類化合物、二芳基庚酸和姜酚生物合成、zma00941 類黃酮生物合成、zma00940 苯丙酸生物合成和zma00195 光合作用。途徑分析表明，這些DEGs 主要與次級代謝和種子發(fā)芽活力相關。轉錄組分析一共鑒定出447 個DEGs 存在于不同發(fā)芽階段的Scil-H7、Scil-C4th 和L18 中，它們可能建立了一個調控網絡，并隨胚發(fā)芽進程而變化。

基于L18 和輪回親本Scil1-C4th 之間相似的遺傳性狀，通過高通量轉錄組測序的方式捕獲與種子活力相關的DEGs 作為候選基因。將Scil-H7 設為參照，在L18、Scil-H7 和Scil1-C4th的兩個發(fā)芽階段比較鑒定出410 個DEGs，其中65 個僅在Scil-H7 和L18 中表達，而不在Scil1-C4th 中表達，這些 DEGs 被認為是與種子發(fā)芽緊密關聯(lián)的調節(jié)因子，可用于后續(xù)功能分析。通過對不同組織樣本的qRT-PCR 驗證，發(fā)現(xiàn)Zm00001d037383（UGT1基因）與低溫發(fā)芽高度相關。

對UGT1基因進行功能注釋與同源基因功能搜索，發(fā)現(xiàn)在擬南芥中UGT1 可以催化單螺旋藻，促進葡萄糖結合；UGT1 的敲除導致木質素單體生物合成，木質素聚合和細胞壁相關轉錄因子表達水平大幅提高，表明UGT1 催化的單螺旋葡萄糖基化對正常細胞壁木質素是必需的，從而在一定程度上闡明了細胞壁發(fā)育和細胞壁木質化的分子機制［25］。然而，細胞壁的發(fā)育是植物種子早期發(fā)芽的重要特征，細胞壁相關基因表達的活躍對植物種子更強的抵抗逆境脅迫能力、快速發(fā)芽與出苗能力具有重要意義。因此，推測UGT1基因可能是Scil-H7 中響應低溫發(fā)芽的重要目標基因。分析UGT1基因在轉錄組測序樣品中的表達量發(fā)現(xiàn)，該基因在玉米種子低溫發(fā)芽過程中表達量迅速增加，表現(xiàn)為低溫脅迫下的迅速響應。UGT1基因在玉米中耐低溫發(fā)芽的作用及其分子機制有待進一步探索。

4 結論

本研究利用高通量轉錄組測序技術，對耐低溫發(fā)芽差異的母本及其自交系后代進行分析，從不同材料在相同時期的4 個比較組（RP-1 vs DP-1、RP-2 vs DP-2、RP-1 vs L18-1、RP-2 vs L18-2）鑒定出共有DEGs 410 個。其中，65 個DEGs 僅在Scil-H7 和L18 中特異表達，32 個基因功能注釋完整，從中進一步篩選出20 個可能與低溫萌發(fā)密切相關的基因。對其中最有可能參與低溫萌發(fā)的7 個上調表達基因進行表達量驗證，其中編碼UDP-葡萄糖基轉移酶的基因Zm00001d037383（UGT1）在DP 胚部表達明顯高于其他組織，推測該基因在甜玉米耐低溫萌發(fā)過程中起關鍵作用。研究結果，為后續(xù)創(chuàng)制低溫萌發(fā)能力更強的甜玉米種質資源奠定了基礎。