許娜，劉馨璐，劉璐，湯蓉，李大鵬

(華中農業(yè)大學水產學院， 長江經濟帶大宗水生生物產業(yè)綠色發(fā)展教育部工程研究中心，水產養(yǎng)殖國家級實驗教學示范中心， 池塘健康養(yǎng)殖湖北省工程實驗室， 湖北 武漢 430070)

養(yǎng)殖魚類在捕撈、運輸或接觸不良環(huán)境脅迫時容易受到損傷，可能誘發(fā)豎鱗病、赤皮病及水霉病等疾病，嚴重影響水產養(yǎng)殖的經濟效益。水霉病是一種常見真菌性疾病[1]。在魚類體表鱗片脫落等受傷情況下，病菌入侵傷口并向外生長，致使病變部位體表附著棉絮狀灰白色菌絲，導致組織發(fā)炎、壞死，并最終致其死亡[2]。

血液中的葡萄糖(GLU)、膽固醇(CHO)、甘油三酯(TG)以及乳酸脫氫酶(LDH)、谷草轉氨酶(AST)和谷丙轉氨酶(ALT)等，作為常見的魚類血液生化指標，其含量水平和酶活水平可以反映出機體物質代謝和能量代謝的基本情況，機體發(fā)生的生理或病理變化也可通過血液生化指標的變化反映出來[3-4]。目前魚類血液生化指標的標準尚未統(tǒng)一，但不少研究結果顯示魚類養(yǎng)殖環(huán)境、營養(yǎng)條件的改變以及感染疾病都會引起血液生化指標發(fā)生顯著變化。高密度養(yǎng)殖導致團頭魴(Megalobramaamblycephala)血清總蛋白(TP)和TG等含量顯著增加，以應對擁擠脅迫時機體對能量的需求[5]。史氏鱘(Acipenserschrenckii)饑餓3 d 后血漿TG和CHO濃度顯著增高，提示在食物剝奪期間魚體脂質代謝增強[6]。大西洋鮭(Salmosalar)感染冷水弧菌病的血清TP、白蛋白(ALB)、TG和CHO均顯著降低，而ALT活性顯著升高，表明肝細胞功能不全，阻礙物質代謝[7]。大黃魚(Pseudosciaenacrocea)患哈維氏弧菌病后血清ALT和AST含量顯著增加，表明魚體在病原菌作用下肝臟組織受損，引起血清酶含量迅速上升[8]。因此，魚類血液生化指標是魚類研究中評估其狀態(tài)的重要參考指標。

生物和非生物條件的變化是水產養(yǎng)殖中常見的應激因素，會引起機體蛋白質代謝的動態(tài)變化[9-10]。熱休克蛋白(HSP)又稱為應激蛋白，通常被認為是細胞應激反應的生物標志物[11]。細胞應激引起細胞蛋白質發(fā)生錯誤折疊，若受損蛋白質不及時降解，將積累形成對細胞有害的聚集體，干擾細胞正常功能[12]。HSPs可作為分子伴侶參與受損蛋白質的修復，一旦無法修復，泛素連接酶(CHIP)將介導泛素化HSPs標記的伴侶蛋白底物，激活泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(UPS)，誘導受損蛋白的降解，維持細胞內蛋白質的代謝穩(wěn)態(tài)，保持細胞的完整性以發(fā)揮其正常功能[13-16]。UPS是真核細胞內調節(jié)蛋白質降解的主要承擔者，細胞內衰老、損傷或錯誤折疊的蛋白質都可通過此途徑被降解[17]。該系統(tǒng)由泛素(ub)、泛素活化酶(E1)、泛素結合酶(E2)、泛素連接酶(E3)及26S蛋白酶體等組成[18]。UPS降解蛋白質一般是通過多個泛素分子在E1、E2和E3的作用下與目標底物蛋白結合，形成一條多聚泛素鏈，進而被26S蛋白酶體識別，降解為小肽或氨基酸[19]。

草魚(Ctenopharyngodonidellus)是中國水產養(yǎng)殖產量排名第一的魚類，年產量超過550萬 t[20]。草魚對外界環(huán)境變化較為敏感，魚體受傷較易感染水霉病。本研究對比分析感染水霉病和健康草魚血液生化指標和肌肉泛素-蛋白酶體系統(tǒng)活性，進而探討水霉病對草魚生理機能和骨骼肌蛋白質降解情況的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗魚

試驗草魚(93.55±2.99) g購自湖北省黃岡市團風縣百容良種場，養(yǎng)殖于華中農業(yè)大學水產學院教學實習基地。水溫為20～23 ℃，pH為(8.06±0.02)，溶解氧為(6.55±0.08) mg/L。養(yǎng)殖期間發(fā)現(xiàn)有的草魚體表附著灰白色絮狀物，用手術鑷取其置于培養(yǎng)皿中，70%乙醇處理后通過顯微鏡觀察，可見管狀菌絲，有分枝但無分隔，菌絲梢端膨大，釋放的動孢子呈梨形，具兩條等長的前鞭毛，以此確定為水霉科，水霉屬(Saprolegnia)。隨機選取10尾感染水霉病的草魚(體表肉眼可見附著厚重水霉，處于患病后期)作為患病組，體重為(91.21±4.51) g，體長為(17.71±0.29) cm；另于無水霉感染養(yǎng)殖缸中挑選10尾體表鱗片完整，無損傷無出血的健康草魚作為對照組，體重為(95.89±4.04) g，體長為(18.22±0.24) cm。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品采集

采用MS-222(間氨基苯甲酸乙酯，200 mg/L)進行魚體麻醉，尾動脈采血，室溫靜置分層后3 000 r/min離心30 min分離血清，-80 ℃保存用于血液生化指標的測定。采集草魚背部白肌液氮速凍后置于-80 ℃冰箱中用于基因和蛋白相對定量表達分析。

1.2.2 血液生化指標測定

葡萄糖(GLU)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、膽固醇(CHO)、甘油三酯(TG)、谷草轉氨酶(AST)、谷丙轉氨酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)和乳酸脫氫酶(LDH)在Selectra XL型全自動生化分析儀(荷蘭威圖科學公司)上測定。試劑盒購自中生北控生物科技股份有限公司(批號依次分別為193681、180531、170631、182041、187881、181371、192711、190651和190681)。

1.2.3 泛素-蛋白酶體系統(tǒng)相關基因表達水平檢測

使用總RNA提取試劑盒(武漢科爾普生物科技有限公司，批號130318)提取背部肌肉總RNA；使用Hifair?Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Super Mix for qPCR (gDNA digester plus) 試劑盒(YEASEN，批號H1816441)進行逆轉錄；使用HieffTMqPCR SYBR?Green Master Mix (Low Rox Plus) 試劑盒(YEASEN，批號H3901010)并在Quant Studio 6 Flex Real-Time PCR Detection System (Applied Biosystems，USA)上進行熒光定量反應。引物序列(表1)及實驗方法參考本實驗室已發(fā)表文章[21]。

1.2.4 泛素化蛋白含量的測定

使用Dot-blot方法測定草魚背部肌肉泛素化蛋白含量。肌肉總蛋白提取使用RIPA裂解緩沖液(廣州捷倍斯生物科技有限公司，批號1707GB010)，濃度由BCA蛋白試劑盒測定(廣州捷倍斯生物科技有限公司，批號1911BCA011)，通過Odyssey CLx (LI-COR, CLx-0813)顯影分析, 使用Image J讀取各斑點灰度值, 進行相對定量分析[21]。

1.3 數據分析

基因相對表達量采用2-ΔΔCt法計算，使用SPSS 17.0軟件對數據進行獨立樣本t-檢驗分析，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。所得數據以平均值±標準誤(Mean±SEM)表示，使用Graphpad Prism.V 5.0作圖。

2 結果

2.1 感染水霉病對草魚血液生化指標的影響

患病組與對照組草魚的血液生化指標測定結果見表2。與對照組相比，患病組草魚的血清CHO、ALB、TP和TG濃度分別下降了22.69%、28.17%、25.56%和17.89%(P<0.05)，GLU濃度有下降趨勢但無統(tǒng)計學意義?；疾〗M草魚血清AST和LDH活性分別是對照組的2.02和1.97倍(P<0.05)，但ALP和ALT活性在兩組間沒有顯著性差異。

表1 熒光定量PCR引物序列Tab.1 Primer sequences for real-time PCR

表2 患病組和對照組草魚的血液生化指標Tab.2 Blood biochemical indices of Ctenopharyngodon idellus in the sick and control group

2.2 感染水霉病對草魚肌肉nrf2和hsp基因表達的影響

水霉病感染顯著上調草魚的nrf2和hsp基因表達。

患病組草魚肌肉nrf2 mRNA表達水平是對照組的6.56倍，hsp70 mRNA表達水平是對照組的6.21倍，hsp90 mRNA表達水平是對照組的2.61倍(P<0.01，圖1)。

圖1 患病組和對照組草魚nrf2、hsp70、hsp90的相對表達量“**”表示組間差異極顯著(P < 0.01)。下同。Fig.1 Relative expressions of nrf2, hsp70 and hsp90 of Ctenopharyngodon idellus in the sick and control group“**” indicate extremely significant differences among groups(P<0.01).The same below.

2.3 感染水霉病對草魚肌肉泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的影響

感染水霉病引起草魚肌肉UPS相關基因表達量和蛋白含量的改變。與對照組相比，患病組草魚肌肉中chip、ub、psma2、psmc1、murf1和mafbx的mRNA表達量皆顯著上調，分別是對照組的1.57、5.15、7.98、4.70、11.98和3.36倍(P<0.01，圖2)?；疾〗M草魚肌肉中泛素化蛋白含量較對照組也顯著性增加(P<0.05，圖3)。

圖2 患病組和對照組草魚肌肉UPS相關基因的相對表達量Fig.2 Relative expressions of genes related to UPS of Ctenopharyngodon idellus in the sick and control group

圖3 患病組和對照組草魚肌肉泛素化蛋白的相對含量“*”表示組間差異顯著(P<0.05)。Fig.3 Relative content of ubiquitinated protein of Ctenopharyngodon idellus in the sick and control group“*” indicate significant differences among groups(P<0.05).

3 討論

CHO主要在肝臟中合成，是碳水化合物、脂質和蛋白質代謝的主要降解產物和指標，肝臟也是合成TG和TP的主要器官，因此血清蛋白質、膽固醇等物質含量與肝臟功能密切相關，其在血清中的含量變化可表示肝功能的好壞[22]。研究顯示魚類感染疾病后期血清TP、CHO、TG和ALB等生化指標呈下降趨勢。余銀春等[23]發(fā)現(xiàn)感染嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)的烏鱧(Channaargus)血清TP、CHO濃度顯著下降，間接表明魚體的肝臟組織發(fā)生病變。類似的結果在張書環(huán)[24]和本研究中也被發(fā)現(xiàn)，說明感染疾病使魚類肝臟受損，合成能力下降，導致血清CHO、TP和TG等物質含量減少。美洲紅點鮭(Salvelinusfontinalis)感染柱狀黃桿菌(Flavobacteriumcloumnare)后血清TP和ALB濃度降低，可能是由于急性免疫過程中蛋白質分解代謝增加或肝臟病變導致蛋白質合成減少所致[25]。本研究發(fā)現(xiàn)水霉菌感染也顯著降低草魚血清ALB和TP含量。機體在病原入侵后啟動免疫防御機制，白蛋白可作為載體對病原進行清除而被迅速消耗[26]。感染疾病后機體分解代謝的增加以及食物攝入的減少可能也是血清蛋白含量降低的原因[25]。

ALT和AST主要分布于肝、腎和肌肉等組織器官的細胞中，正常情況下在血清中保持低水平且相對穩(wěn)定的酶活，當肝臟等組織受到損傷或脅迫時，血液中這兩種酶活將升高，因此二者是肝臟等組織器官受損的重要指示酶[22]。研究發(fā)現(xiàn)，水霉菌感染的虹鱒(Oncorhynchusmykiss)[27]和鯉(Cyprinuscarpio)[28]的肝臟、脾臟和腎臟3種組織均有不同程度的損傷，洋蔥霍爾德氏菌(Burkholcepacid)感染的加州鱸(Micropterussalmoides)[29]、柱狀黃桿菌感染的黃顙魚(Ruditapesphilippinarum)[30]以及水霉菌感染的草魚血清中AST活性皆顯著上升，說明感染疾病損傷機體肝腎等組織器官，細胞內酶大量逸出，導致血清酶活性顯著增強。LDH在橫紋肌細胞內含量最高，其在血清中的含量變化與魚體肌肉組織的健康狀況有關[31]。氣單胞菌(Aeromonas)感染或病毒性出血性敗血癥引起虹鱒皮膚發(fā)生病變或肌肉出現(xiàn)條紋狀或瘀點性出血，伴隨著血清LDH活性增長[32-33]。本試驗中患病組草魚LDH活性顯著增強，表明其肌肉組織受損，阻礙肌肉代謝，這與草魚感染處體表的鱗片皮膚潰爛直見肌肉的現(xiàn)象相吻合。ALP是一種重要的代謝調控酶，在魚類非特異性免疫方面具有重要作用，有助于提高魚的抗病力[34]。研究未發(fā)現(xiàn)累枝蟲(Epistylisunioi)寄生的黃顙魚[35]和水霉菌感染的草魚血清ALP活性有顯著變化，說明患病魚非特異性免疫能力下降，抗病能力減弱。

黃建等[28]研究發(fā)現(xiàn)，感染水霉病的鯉組織細胞內氧化水平-抗氧化水平失衡，魚體產生氧化應激，破壞細胞的正常生理功能，導致組織損傷。核因子E2相關因子2(Nrf2)-抗氧化反應元件(ARE)是機體對抗氧化應激最重要的內源性信號通路，Nrf2是機體在應對氧化應激時啟動細胞防御體系的關鍵調控因子[36]。研究表明，氧化應激激活Nrf2，并啟動下游蛋白酶體/分子伴侶類基因的轉錄和表達以抵抗有害刺激[37]。黑頭軟口鰷(Pimephalespromelas)感染鯉春病毒血癥病毒(infection with spring viraemia of carp virus，SVCV)后上皮瘤細胞Nrf2的基因轉錄水平和蛋白表達量均顯著增加[38]，草魚在48 h的急性擁擠脅迫后肌肉nrf2和hsp70 mRNA表達顯著上調[39]，細胞應激反應被誘導。而草魚在70 d的慢性擁擠脅迫后，肌肉的nrf2和hsp90 mRNA表達水平沒有發(fā)生變化，說明魚體適應了脅迫環(huán)境，應激反應不顯著[21]。本試驗發(fā)現(xiàn)，感染水霉病草魚的肌肉nrf2、hsp70和hsp90 mRNA水平均顯著高于對照組，說明細胞產生應激反應，發(fā)生了氧化應激，Nrf2調控因子被激活以啟動細胞防御體系，增強機體抵抗氧化應激反應的能力，并上調分子伴侶HSP基因的轉錄和表達以協(xié)調受損蛋白質的降解。

目前普遍認為氧化應激造成蛋白質合成與降解失衡，進而導致肌肉萎縮[40]。在應激條件下，細胞蛋白質發(fā)生錯誤折疊，當HSP作為分子伴侶重折疊不成功時，受損蛋白質由泛素連接酶CHIP呈遞給UPS降解[14-15]。研究發(fā)現(xiàn)，比目魚(Pleuronectiformes)[41]和草魚[39]在擁擠脅迫后，骨骼肌中UPS相關基因的表達量和泛素化蛋白質的含量皆顯著上調。在本研究中，感染水霉病也引起草魚肌肉ub等UPS相關基因表達量的顯著上升和泛素化蛋白質的高表達，表明生理和病理應激條件下都能激活UPS，造成泛素化蛋白質的積累。UPS被激活以調節(jié)蛋白質合成和降解過程的動態(tài)平衡，維持細胞蛋白質穩(wěn)態(tài)[17]，失衡則會造成機體損傷。泛素連接酶MAFbx和MuRF1的基因表達水平可以作為骨骼肌蛋白質降解的分子標記物，在肌肉相關疾病的診斷中起到輔助作用[42]。感染水霉病草魚的murf1和mafbxmRNA水平的高表達說明骨骼肌蛋白質降解被增強，最終可能導致肌肉萎縮。

綜上所述，水霉菌感染造成草魚血清酶活性增強，白蛋白、總蛋白和膽固醇等物質含量降低，引起機體產生應激反應，激活骨骼肌泛素-蛋白酶體系統(tǒng)，提高了蛋白質降解速率。本研究關于血液生化指標和肌肉UPS活性變化的研究，將有助于更深入地了解水霉病對草魚生理狀態(tài)的影響，為水霉病的診斷和防治提供科學的參考依據。