德央 曲吉

西藏自治區(qū)血液中心 西藏拉薩 850000

血液安全是目前全世界廣泛關(guān)注的焦點，為了保證輸血的安全可靠，世界衛(wèi)生組織（WHO）建議對每一位獻血者進行健康征詢及血源性傳染病的篩查[1]。隨著科學(xué)的進步發(fā)展，Busch 等科研人員通過研究證實核酸檢測能將HBV、HCV 和HIV 血清學(xué)檢測的窗口期縮短[2]。本中心也于2019 年開展核酸檢測工作，本文以初步了解拉薩地區(qū)無償獻血者的乙肝病毒感染情況，對比了NAT 與ELISA 檢測技術(shù)在乙肝病毒篩查中的臨床意義，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 樣本來源

本中心于2019年1月～2020年9月采集的5999 例無償獻血者標本，初篩合格，且符合《獻血者健康檢查要求》（GB18467-2011）。每位無償獻血者共收集3 管標本，第1 管為分離膠促凝真空采血管用于EIA 檢測及谷丙轉(zhuǎn)氨酶檢測；第2 管為EDTA-K2 抗凝真空采血管用于核酸檢測；第3 管同為EDTA-K2 抗凝真空采血管，是核酸檢測備用管（需要復(fù)檢時使用）。核酸管采集后保證4h 內(nèi)離心（3500rpm/min），三管均保存于2～8℃，24h 內(nèi)檢測（備用管于-20℃凍存，只可復(fù)溶一次）。

1.2 方法

1.2.1 ELISA 篩查試劑與儀器

每個檢測項目均采用兩種不同的試劑盒來進行檢測。HbsAg 由上?？迫A及廈門英科新創(chuàng)，實驗操作過程均嚴格按照實際說明書進行。儀器:E-STARLET 全自動加樣儀和酶免分析儀。

1.2.2 NAT 檢測試劑與儀器

篩選出ELISA 檢測合格的標本進行核酸試驗單檢流程，嚴格按照達安基因核酸試劑說明書做好試劑準備、加樣及PCR 擴增準備工作。儀器為DA3500 全自動核酸提取儀和安譽AFD9600 擴增儀。

1.2.3 復(fù)檢及確認

對鑒定檢測均為反應(yīng)性的獻血者需定期采取血樣進行ELISA、核酸檢測，觀察該獻血者ELISA 檢測是否轉(zhuǎn)陽，以給獻血者作出最終解釋。

1.3 檢測結(jié)果判定

1.3.1 ELISA 結(jié)果判定

＜Cutoff 值判為陰性，≥Cutoff 值判為陽性。兩種試劑均反應(yīng)性則為陽性不合格，否則為陰性；若只有其中一種試劑為陽性則該樣本兩種試劑皆復(fù)檢兩孔，均為陰性則合格，均為陽性或其一為陽性則判不合格。

1.3.2 NAT 結(jié)果判定

1.3.2.1 質(zhì)控品結(jié)果判定（暨批實驗有效性）

陰性質(zhì)控品除內(nèi)標Ct ≤40 外，其他均無值，否則重測；陽性質(zhì)控品檢測項均為Ct ≤40，否則重測；室內(nèi)質(zhì)控品檢測項均為Ct ≤45，否則重測。

1.3.2.2 待測標本結(jié)果判定（暨單測試有效性）

在本批次試驗質(zhì)控有效，并且內(nèi)標（IC）有效的條件下，本批次試驗結(jié)果有效且可參考。陽性判斷標準為有明顯S 型擴增曲線且標本檢測結(jié)果Ct 值≤45，則結(jié)果判為有反應(yīng)性。陰性判斷標準為無明顯S 型擴增曲線，標本檢測結(jié)果的Ct 值為“無值”，且相應(yīng)的內(nèi)對照結(jié)果Ct 值≤40。若本次結(jié)果出現(xiàn)反應(yīng)性，則取該樣本的備用管雙孔復(fù)檢，若再次呈反應(yīng)性，則判定該項目為陽性，若無反應(yīng)性則判為陰性。

1.3.2.3 內(nèi)標檢測的有效性判定

標本測定結(jié)果如果為核酸陰性，則內(nèi)標結(jié)果必須為陽性，否則標本的測定結(jié)果無效重新測定。標本測定結(jié)果如果為核酸陽性，內(nèi)標結(jié)果可以不做考慮。

2 結(jié)果

2.1 HBV 檢出率

在5999 份血液標本中，采用ELISA 和NAT 兩種方法檢測后，共檢出HBV 陽性標本65 份，HBV檢出率為1.08%（65/5999）。

2.2 兩種檢查的特異性、靈敏度

2.2.1 ELISA 的特異性、靈敏度結(jié)果

5999 份 血 液 標 本 中，ELISA 檢 出33 份 標 本HBV 陽性，檢出率0.55%。追蹤1 月后，再次檢測出30 份陽性。因此，ELISA 在BHV 病毒檢測中的靈敏度為52.38%、特異性為50.77%。

2.2.2 NAT 的特異性、靈敏度結(jié)果

NAT 檢測方法，對5999 份血液標本中檢出65份BHV 陽性，檢出率1.08%。追蹤1 月后，再次檢測出63 份陽性。對于NAT 在檢測BHV 中的靈敏度100%、特異性為96.92%。

2.3 兩種檢測特異性、靈敏度的對比 見表

3 討論

本中心地處西藏自治區(qū)首府拉薩，拉薩地區(qū)流動人口數(shù)量龐大，居民的乙肝疫苗接種意識不強，而且針對傳染病的防范意識薄弱。2011～2015 年的調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，拉薩地區(qū)獻血人群HBsAg 檢出率是1.06%，高于當時的銀川、南京等地區(qū)[3,4]。本次檢測結(jié)果顯示，2019～2020 年拉薩地區(qū)獻血人群HBsAg 檢出率為1.08%，和往年水平相當。提示西藏自治區(qū)血液安全問題依然存在，不容忽視，采血人員需要重點關(guān)注；此外需繼續(xù)加強對乙肝等傳染病的健康教育，提高乙肝疫苗的接種率。

本組結(jié)果顯示，ELISA 檢測方法的靈敏度為52.38%，特異性50.77%，均處于較低水平。文獻研究顯示，以抗原抗體為檢測對象的酶聯(lián)免疫檢測方法，“窗口期”較長，尤其是抗體，由于抗體的產(chǎn)生需要從病毒進入體內(nèi)刺激機體發(fā)生免疫反應(yīng)，再到抗體足以被檢出，這個過程需要更長的時間，因此導(dǎo)致酶聯(lián)免疫檢測最重要的漏檢因素為“窗口期”漏檢[5,6]，此外，也可能會存在隱匿性的HBV 感染（OBI），此感染者由于自身免疫或病毒的變異等因素導(dǎo)致抗原結(jié)構(gòu)改變，導(dǎo)致血清學(xué)檢測呈陰性，本組就有30 人份血樣就是“窗口期”，漏檢率較高，因此在臨床工作中對于一次檢測HBV 陰性者，一定要有半個月以上的追蹤、復(fù)查。不可掉以輕心，這關(guān)系到受血者的健康問題。但因為ELISA 檢測在檢驗室中應(yīng)用交廣，且時間長?；鶎訉嶒炇揖溆?，操作簡單，費用不高，社會效益高。NAT 檢測可檢出存在于血清中HBV-DNA[7]，能在早期檢測出HBV感染，可以忽略“窗口期”直接發(fā)現(xiàn)病毒。本組中NAT 的靈敏度為100%，特異性為96.92%，處于較高水平，故，作者建議有條件的醫(yī)療機構(gòu)在血液篩查中盡可能的采用NAT 檢測，當然在安全血液的篩選試驗中，NAT 也能夠很好的與ELISA 檢測起到互補作用。通過兩種檢測方法比較，結(jié)果顯示核酸檢測能更進一步的保證臨床供血的安全可靠性，在發(fā)現(xiàn)“窗口期”及隱匿性病毒感染的檢測中，發(fā)揮著重大的作用。