丁巳娟 韓起 陳生林 馮東方
西藏軍區(qū)總醫(yī)院 西藏拉薩 850000
電子顯微鏡技術(shù)(Electron—microscopy,EM)已經(jīng)有近100 年歷史,適應(yīng)其不同功能需要逐步發(fā)展形成透射電鏡和掃描電鏡技術(shù),分別用于樣品內(nèi)部結(jié)構(gòu)及自然形貌的分析。電鏡的分辨率不斷提高,目標(biāo)是超微檢測(cè)、動(dòng)態(tài)觀察和分析計(jì)算有機(jī)結(jié)合。病毒是目前所知結(jié)構(gòu)最為簡(jiǎn)單的生命單位,具有特定超微結(jié)構(gòu)特征,但是病毒具有復(fù)雜的變異及進(jìn)化過(guò)程。在19 世紀(jì)末,人們就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)存在比細(xì)菌還小的生物有機(jī)體,但是真正觀察到病毒還是在電鏡技術(shù)發(fā)展成熟后。因此電鏡技術(shù)是推進(jìn)病毒學(xué)發(fā)展的重要手段。
電鏡技術(shù)檢測(cè)病毒的主要優(yōu)點(diǎn)在于無(wú)需特異性生物試劑可直接觀察,而分子生物學(xué)、血清學(xué)檢測(cè)方法則需要特異性探針發(fā)現(xiàn)病毒。一般情況下,新發(fā)疾病的致病因素很難確定,但是運(yùn)用電鏡技術(shù)可直接觀察病原體,如病毒。然而分子生物學(xué)檢測(cè)手段需提前獲取檢測(cè)對(duì)象的生物特異性。雖然電鏡技術(shù)只能觀察到病毒表征不能確定種屬,但其觀察數(shù)據(jù)給其他更具特異性的生物學(xué)檢測(cè)手段指明了目標(biāo)。如果病毒的體外培養(yǎng)模型尚未建立,生物學(xué)方法研究病毒就顯得非常困難。此時(shí)電鏡就顯得格外重要,即使當(dāng)今分子生物學(xué)診斷檢測(cè)技術(shù)迅猛發(fā)展,也需先通過(guò)電鏡技術(shù)來(lái)檢測(cè)一些新的、非常規(guī)的病毒為其做進(jìn)一步研究鋪墊。電鏡還可以用來(lái)研究病毒附著、復(fù)制的分子機(jī)制,其研究結(jié)果有助于開(kāi)發(fā)抗病毒藥物和疫苗。
Ernst Ruska 和Max Knoll 發(fā)明了電鏡,隨后Ruska、Kausche 和Pflankuch 首次用電鏡觀察到病毒。1952 年,電鏡技術(shù)首次揭開(kāi)了脊髓灰質(zhì)炎病毒的面紗。20 世紀(jì)50 年代中期,采用電鏡技術(shù)開(kāi)始進(jìn)行對(duì)病毒與宿主細(xì)胞關(guān)系的研究。而早期的病毒學(xué)分類主要就是依靠電鏡觀察結(jié)果。通過(guò)采集糞便標(biāo)本,用負(fù)染色技術(shù),用電鏡還發(fā)現(xiàn)了許多腸道病毒。電鏡技術(shù)的運(yùn)用成功發(fā)現(xiàn)了1976 年大暴發(fā)的埃博拉病毒。1999 年,運(yùn)用電鏡技術(shù)發(fā)現(xiàn)了可以引起皮膚異常病變、免疫抑制的病毒-多瘤病毒。此外,最為著名的是用電鏡技術(shù)發(fā)現(xiàn)了SARS 的致病因子-冠狀病毒[1]。使用電鏡觀察病毒并不要求病毒的完整性或致病性,因此成功鑒定出天花病毒。另外,由于電鏡技術(shù)檢測(cè)速度快,不少國(guó)家的CDC 部門(mén)常用其監(jiān)測(cè)生物(病毒)武器[2]。目前,用來(lái)快速檢測(cè)新發(fā)病毒的電鏡技術(shù)已經(jīng)越來(lái)越成熟和規(guī)范。
負(fù)染技術(shù) (Negative staining) 是透射電鏡觀察病毒形態(tài)的核心技術(shù)之一,其應(yīng)用很大地促進(jìn)了病毒形態(tài)學(xué)和病毒電鏡檢測(cè)的發(fā)展[3]。對(duì)于病毒樣品的檢測(cè),需要在銅網(wǎng)上放置一支持膜才能保留這些小顆粒病毒。常用的膜劑有:Formvar,Collodion,Butvar,和Pioloform[4]。這些膜劑可形成超薄膜且具有導(dǎo)電性,在電子束照射下不會(huì)融化?,F(xiàn)已有商品化的鋪好膜的銅網(wǎng),但由于膜的有效保存時(shí)間很短,因此,其成品銅網(wǎng)商品化受到一定限制。由于要保證樣品在膜上的平整性,這些膜還必須是具有親水性的。
常用的負(fù)染劑有uranyl acetate 和 phosphotungstic acid (PTA)。Uranyl acetate 既是固定劑也是染色劑,可觀察到病毒完整形態(tài)和顆粒表面,但該試劑在磷酸鹽存在下會(huì)發(fā)生沉淀且具有放射性。PTA 不具有放射性,在磷酸鹽下不會(huì)沉淀,可觀察到有包膜病毒表面刺突,但在幾個(gè)小時(shí)后會(huì)降解病毒[4]。
為了提高病毒負(fù)染樣本檢測(cè)敏感度,可以采用提高樣本內(nèi)病毒濃度的方法和提高載網(wǎng)吸附病毒能力的方法這兩種方法,而提高樣本內(nèi)病毒濃度的方法包括超速離心法、瓊脂過(guò)濾法、凍干法、超濾法、沉淀法、離子交換捕獲法、假?gòu)?fù)型法、免疫負(fù)染法,提高載網(wǎng)吸附病毒能力的方法包括輝光放電、紫外線照射、多聚賴氨酸 (Poly2L2lysine) 增強(qiáng)吸附法、增加載網(wǎng)表面親水性的試劑等方法[5]。
由于組織標(biāo)本太厚,電子束不能全部穿透,因此就需要使用超薄切片技術(shù)對(duì)組織標(biāo)本進(jìn)行預(yù)處理。常規(guī)用于組織的超薄切片技術(shù)也適用于病毒檢測(cè)。制作超薄切片的過(guò)程主要有固定、漂洗、脫水、浸透、環(huán)氧樹(shù)脂包埋、超薄切片。超薄切片應(yīng)用于病毒檢測(cè)的主要缺點(diǎn)在于,如果病毒僅存在樣品局部,那么切片時(shí)很可能得不到含有病毒的切片[6]。對(duì)于體外細(xì)胞培養(yǎng)下的病毒研究,電鏡觀察病毒時(shí),可將這些細(xì)胞做離心處理,再對(duì)沉淀物用戊二醛固定,使它們聚集成團(tuán)塊,再做后續(xù)的常規(guī)切片處理。
超薄切片染色作為電鏡生物樣品制備的最后一步,染色好壞直接影響到電鏡照片的質(zhì)量。文獻(xiàn)報(bào)道,超薄切片過(guò)程中對(duì)樣本采用插入式滴染法、連續(xù)染色方式、微波輔助染色等技術(shù)能夠有效提高染色效率,減少染色污染,進(jìn)而在電鏡下顯示清晰的超微結(jié)構(gòu)[7]。
1941 年,病毒學(xué)家通過(guò)煙草花葉病毒首次觀察到抗體-病毒凝集反應(yīng)[8]。Almeida 和Waterson 用電鏡觀察到病毒顆粒凝集現(xiàn)象[9],免疫電鏡應(yīng)運(yùn)而生,它可以有效提高病毒檢測(cè)的靈敏度。液相免疫電鏡檢測(cè)觀察病毒時(shí)利用病毒和抗體反應(yīng)的特異性找到病毒,但如果抗體過(guò)量可能導(dǎo)致病毒表面被包裹,不利于病毒的觀察。而對(duì)于固相免疫電鏡,抗體首先需粘附在銅網(wǎng)上后再和病毒顆粒發(fā)生作用,使病毒顆粒固定在銅網(wǎng)上進(jìn)行負(fù)染色。免疫電鏡可被用于觀察那些研究較為表淺、不能在體外細(xì)胞培養(yǎng)條件下進(jìn)行孵育的病毒,常常采用抗血清直接處理病毒感染標(biāo)本,篩選出病毒進(jìn)行免疫電鏡觀察。而對(duì)于那些新發(fā)未知病毒,其抗原抗體特性未知,則可采用廣譜的丙種球蛋白來(lái)篩選病毒進(jìn)行免疫電鏡觀察。
電鏡技術(shù)結(jié)合免疫金、免疫金銀標(biāo)記法對(duì)病毒進(jìn)行觀察,可以發(fā)現(xiàn)不同的病毒蛋白在細(xì)胞中的定位特點(diǎn),比如通過(guò)超薄切片技術(shù)結(jié)合免疫金銀染色發(fā)現(xiàn)了HIV 的反義蛋白及其與宿主細(xì)胞膜的定位關(guān)系[10]。
免疫電鏡技術(shù)已成為分子細(xì)胞生物學(xué)研究的重要手段。該技術(shù)利用超薄切片和免疫標(biāo)記能夠準(zhǔn)確的定位蛋白質(zhì)和脂類[11]。
快速將病毒懸浮液冷凍后成為玻璃狀樣品,可以保證病毒結(jié)構(gòu)的原始性。樣品通常被迅速放置于液氮中進(jìn)行處理,然后轉(zhuǎn)移至電鏡的低溫樣品室進(jìn)行觀察,再通過(guò)數(shù)字成像技術(shù)多角度對(duì)樣品進(jìn)行圖片采集,經(jīng)過(guò)計(jì)算機(jī)三維重構(gòu)得到病毒完整三維形態(tài)圖片。另外,通過(guò)這一技術(shù)還可觀察到抗病毒藥物作用于病毒后,病毒形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變的特征[3]。
冷凍電子顯微學(xué)和電子斷層成像依然是一個(gè)年輕的學(xué)科,處于發(fā)展和完善階段,要采用更好的樣品制備方法(如高壓冷凍、冷凍替代、冷凍切片等),改進(jìn)數(shù)據(jù)收集方法、硬件及軟件,發(fā)展更好的電子斷層成像數(shù)據(jù)處理、分析和理解方法,結(jié)合電子斷層成像和單顆粒分析技術(shù)獲得更多的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié),發(fā)展新的電子斷層成像技術(shù),才能更好地促進(jìn)冷凍電子斷層成像技術(shù)在病毒檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用[12]。
用電鏡觀察那些可感染人類的病毒時(shí)要相當(dāng)小心,樣品處理過(guò)程最好在生物二級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行研究,包括銅網(wǎng)負(fù)染色步驟,并且將銅網(wǎng)拿出實(shí)驗(yàn)室放置電鏡進(jìn)行觀察之前,要保證銅網(wǎng)上的病毒已無(wú)感染性。
綜上所述,電鏡技術(shù)在不斷的發(fā)展過(guò)程中充分與免疫學(xué)、細(xì)胞化學(xué)等技術(shù)相融合,可直接觀察到生物細(xì)胞內(nèi)的病毒粒子及大分子,對(duì)于新發(fā)和未知病原體的研究起著重要的診斷作用。本文僅闡述了基于電子顯微鏡研究病毒涉及到的相關(guān)技術(shù),隨著電子顯微技術(shù)的發(fā)展以及制樣方法的不斷改進(jìn)和完善,這將極大的發(fā)揮電子顯微鏡技術(shù)的優(yōu)勢(shì)并克服其局限性,電子顯微鏡技術(shù)也會(huì)在病毒診斷領(lǐng)域中發(fā)揮更大的作用。